[1] IF5.458 Increased LDL receptor by SREBP2 or SREBP2-induced lncRNA LDLR-AS promotes triglyceride accumulation in fish. iScience

1. T7体外生物素标记转录试剂盒1次转录出的探针，能做多少次pulldown实验？

1次转录出的探针，一般可以做2-3次pulldown实验。

2.如何制备DNA模板？

DNA模板主要有两种：PCR产物和线性化质粒。其制备方法分别为：

（1）PCR产物：1）设计引物（上游引物5’端含有T7启动子序列）；2）用高保真DNA聚合酶进行PCR；3）PCR产物电泳后割胶回收。

（2）线性化质粒：1）设计引物（上游引物5’端含有T7启动子序列，下游引物含有可致5’突出端/平末端的酶切位点）；2）用高保真DNA聚合酶进行PCR；3）PCR产物连接克隆载体；4）质粒抽提及酶切线性化

3.转录后RNA如何纯化？

Trizol LS Reagent、磁珠或过柱纯化试剂盒。

4.转录结束后如何去除DNA模板

向反应液中依次添加68 μL RNase-Free Water，10 μL 10× DNase Reaction Buffer，和2 μL RNase-Free DNase I (1 U/μL)，置于PCR仪上37℃孵育15 min。

5.合成的RNA电泳为何有杂带？

原因有2种：1）RNA二级结构所致：RNA未变性电泳会出现“杂带”；2）DNA模板不纯导致合成的RNA电泳有杂带。

6.RNA产量低或无RNA合成

1) 酶保存不当导致酶失活。

2）亚精胺浓度过高会导致DNA模板沉淀，最终导致RNA产量低。

建议将除了酶以外的组分平衡至室温后，再按以下顺序加样：H2O-buffer-NTP-模板-酶;

3) T7启动子缺失或错误，或T7启动子位于模板DNA下游。