利用随机引物对富集后的circRNA进行滚环反转录扩增，采用纳米孔测序技术对circRNA的全长序列进行直接测序，并使用特定算法，实现对长测序片段中的circRNA序列进行识别和全长重构。

图1：circRNA全长纳米孔测序技术路线

测序方案

测序模式：Nanopore sequencing

测序数据量：1 Gb raw data

纳米孔测序技术在检测circRNA上的优势：

1.更强的检出率：相比二代测序，纳米孔测序可以将circRNA reads检测效率提高20倍以上。

2.更高的灵敏度：可识别低丰度的circRNA，能够更敏感地捕获到非经典circRNA，ieintronic。

3.更多更准确的应用领域：

1）准确识别可变剪切事件，无需拼接，一键生成；

2）直接识别癌症等重大疾病发生发展的重要生物标志物一一融合环状RNA(f-circRNA)；

3）能够更敏感的识别研究热点一一线粒体环状RNA，确保您的研究不会落空。

基于三代测序技术分析circRNA全长

Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long. Zhang J et al. Nature biotechnology, 2021. (IF: 36.558)

测序策略：circRNA Nanopore sequencing

研究样本：小鼠脑组织

本研究开发了一种高效测定circRNA全长转录本的实验和计算方法：利用随机引物对circRNA进行的滚环反转录扩增后，使用纳米孔测序技术对circRNA的全长序列进行直接测序，并开发了CIRI-long 算法，实现对长测序读段中的circRNA序列进行准确识别和全长重构。

作者发现优化后的纳米孔测序体系能够在总Reads中测到6%的circRNA信息，而在传统的PE150二代测序数据中，总RNA测序结果中只有0.06%的Reads是circRNA数据，RNase R处理也只能得到0.27% 的circRNA数据。相对于二代测序，纳米孔三代测序结合CIRI-long分析方法可以将检测效率提高20多倍。并且，纳米孔三代测序能够实现<100bp~5kb长度circRNA的全序列组装，而二代测序（PE150）仅能拼接300bp以内的序列。比较对照的二代测序数据以及CircAtlas数据库信息，本文的体系得到了更多circRNA信息。纳米孔测序得到了一半多的全新circRNA，但这些circRNA的丰度较低，说明纳米孔测序体系具有更高的灵敏度，可以检测到更多的circRNA分子（图1）。两次生物学重复的样品能很好地吻合，说明该体系具有较高的稳定性（图2）。

Figure.纳米孔测序体系具有更强的检出率

Figure.纳米孔测序体系具有较高的稳定性

 circRNA可变剪切是多样性的重要体现，作者从这批纳米孔测序数据中分析了circRNA可变剪切的情况，在15905个基因来源的circRNA中共分析到115755种可变剪切分子。而二代测序的数据中只从6928个基因中分析到了25159种可变剪切分子。四种类型的可变剪切都存在，总体而言，在纳米孔测序的数据中分析得到的可变剪切数目均高于二代测序的数据（图3）。作者还发现了内含子自动形成的circRNA（图4）。

Figure. CIRI-long分析circRNA和剪切多样性

Figure.内含子自剪切形成的circRNA

生物信息分析

基础分析

原始数据质控检查

比对结果质控检查

样品表达质控

基于circRNA表达的样品主成分分析

circRNA全长鉴定

circRNA在染色体上的分布特征分析

circRNA长度统计与分析

circRNA可变剪切isoform识别

高级分析

circRNA差异分析

差异circRNA宿主基因的GO功能分析

差异circRNA宿主基因的KEGG通路富集分析

差异circRNA宿主基因的Reactome通路富集分析

差异circRNA的靶向miRNA预测分析

circRNA及靶向miRNA网络调控图

circRNA-RBP 关系预测

circRNA 翻译潜能预测

个性化分析

融合基因来源的f-circRNA识别融合基因来源的f-circRNA

部分结果展示

图1：circRNA全长纳米孔测序鉴定隐藏且复杂的转录与可变剪切图谱

图2：mmu-circMsrb3 0004在小鼠心脏/脑中的表达水平

小鼠基因Msrb3只包含3个线性转录本，却能够转录至少10个环状转录本分子（如图1）。circRNA全长纳米孔测序鉴定出的circRNAs多种多样，包括exonic circRNAs、ElciRNAs、intronic circRNAs，相比lllumina仅仅检测BSJ，Nanopore全长鉴定能够观察到circRNA真实的内部构造，甚至发现新的circRNA外显子（如图1中红色框）。

特别地，Nanopore以及lllumina都检测到mmu-circMsrb3_0004在小鼠心脏/脑中有较高的表达（如图2），circRNA全长纳米孔测序更是识别到该环状分子的3个isoforms。

图3：Nanopore与lllumina测序circRNA丰度比较

图4：circRNA全长纳米孔测序检测到6号染色体的基因SCAF8的外显子3-4与QKI的外显子5发生了融合，并形成了环状RNA分子。

图5：circRNA全长纳米孔测序在人类前列腺癌细胞中检测到了大量线粒体环状RNA，这些分子主要分布于轻链。

Table.ONT circRNA full-length Seq原始样本送样建议

Table.ONT circRNA full-length Seq RNA样本送样建议

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物种范围：人、小鼠、大鼠等哺乳动物，拟南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等植物，其他物种详询销售或技术支持