利用circRNA对RNase R的耐受性从而富集circRNA，去rRNA后进行链特异建库，采用Illumina平台对circRNA文库进行测序，通过生信分析得到circRNA的表达结果。

circRNA测序技术路线

测序方案

测序平台：Illumina Novaseq 6000/NovaSeq X Plus

测序模式：PE150

测序数据量：10 Gb raw data

人喉鳞状细胞癌中circRNA的RNA-seq表达谱

RNA-Seq profiling of circular RNAs in human laryngeal squamous cell carcinomas

Lu et al. Molecular Cancer (2018) 17:86（IF：6.204）

测序策略：circRNA测序（RNase R+）

样本分组：10例，5例肿瘤组织（2例高分化，3例中分化），5例正常组织

人喉鳞状细胞癌(LSCC)是起源于喉黏膜上皮组织的恶性肿瘤，是头颈部肿瘤中恶性程度非常强的肿瘤，世界范围内每年发生率占比2.4%，近年内还有逐渐增加趋势。本研究主要关注circRNA在LSCC疾病中的表达情况。研究者选择10例LSCC患者临床组织标本（2例高分化、3例为中分化、 5例正常）进行RNA高通量测序，分析样本中circRNA表达情况。共鉴定出21444个circRNA，其中在LSCC样本中显著上调的circRNA 29个，显著下调circRNA 19个，进一步结合临床特征（高分化，中分化和正常）进行分类，将差异表达circRNA缩小到18个和5个（图1）。CircRNA-miRNA-mRNA调控网络预测分析，发现20个失调控circRNA与多种肿瘤相关的miRNA相关，信号通路KEGG富集分析发现，过氧化物酶体PPAR、轴突导向、Wnt和细胞周期通路与LSCC密切相关（图2）。随后的qPCR验证结果显示（图3），has_circ:chr20:31876585-31,897,648可以很好区分LSCC标本和正常标本，表明circRNA可作为LSCC潜在的理想标志物。

图3 hsa_circ:chr20:31876585–31,897,648在10对LSCC肿瘤样本及正常样本中的Q-PCR验证

生物信息分析

基础分析

原始数据质控检查

比对结果质控检查

基因覆盖度分析

circRNA预测及鉴定

circRNA序列预测

基于circRNA表达的样品主成分分析

高级分析

circRNA差异分析

差异circRNA宿主基因的GO功能分析

差异circRNA宿主基因的KEGG通路分析

差异circRNA宿主基因的Rectome通路分析

差异circRNA的靶向miRNA预测分析

差异circRNA及靶向miRNA网络调控制图

部分结果展示

图1：根据不同的基因组位点（外显子、内含子、反义、基因内和基因间）对表达差异显著的circRNA进行分类

图2：绘制火山图、Circos图揭示每个circRNA在人类染色体上的位置

图3：热图、火山图分析circRNA的表达差异倍数

Table.circRNA-seq原始样本送样建议

Table.circRNA-seq RNA样本送样建议

*更具体的送样方法请咨询销售或技术支持

物种范围：人、小鼠、大鼠等哺乳动物，拟南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等植物，其他物种详询销售或技术支持

Q1：circRNA测序与全转录组测序有什么不同？

A1：全转录组测序采用去rRNA链特异性的建库方式，数据分析内容包含了mRNA、lncRNA及circRNA全部信息，数据质量较好。CircRNA测序采用去rRNA去线性链特异性的建库方式，通过RNase R 消化线性RNA从而富集circRNA，对建库起始量要求较高（一般大于2μg），测序数据质量较全转录组稍差，但可将circular junction reads数提高10倍以上，更适合专注circRNA研究的项目。