我们都知道，经典的翻译要依赖于m7G帽子结构，而环状的结构让 circRNA 只能通过非经典的方式启动翻译，包括通过 IRES（Internal Ribosome Entry Site）介导 circRNA 的翻译起始。

案例1：

2019年12月21日，俄克拉荷马大学Chuanbin Mao和上海第四人民医院/长海医院刘善荣教授为共同通讯作者在ADVANCED SCIENCE （IF= 15.804）杂志上发表了一篇题为“Circ-MALAT1 Functions as Both an mRNA Translation Brake and a microRNA Sponge to Promote Self-Renewal of Hepatocellular Cancer Stem Cells”的文章，报道在肝癌肿瘤干细胞（CSC）中发现了高表达的环状RNA，circ-MALAT1。该分子通过两种方式发挥功能：一方面，circ-MALAT1通过海绵miRNA(miR-6887-3p)上调癌基因(JAK2)和增加磷酸化JAK2，增强JAK2/STAT3信号通路，从而积极地促进CSC的自我更新：另一方面，circ-MALAT1可以通过抑制mRNA翻译过程，直接抑制PAX5 mRNA的翻译，这种mRNA Translation Brake是一种全新的circRNA功能机制形式，值得关注（[1]）。

图1 circ-MALAT1作为mRNA Brake抑制PAX5翻译

本文研究中，circ-MALAT1上有两个IRES和一个含有11个碱基的区域。RIP、qRT-PCR、RNA pull down、IRES和11个碱基突变实验证实了circ-MALAT1分别通过IRES和11个碱基与核糖体和PAX5 mRNA 形成三元复合物来阻止PAX5的翻译，并且这种结合具有序列特异性。

案例2：

金哲教授（深圳大学），秦颖副主任医师（深圳市第二人民医院）和Song Li（深圳市科技发展交流中心）共同通讯在Mol Cancer发表文章A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression。研究发现，相比于相邻正常胃组织，circAXIN1在GC组织中高表达。CircAXIN1编码一种295个氨基酸（aa）的新蛋白质，命名为AXIN1-295aa。

本文研究中，作者对五对GC样本进行高通量测序，差异表达的circAXIN1被提示编码一种新的蛋白质。CircAXIN1编码一种新的蛋白质AXIN1-295aa。如图1所示，作者分别使用在过表达载体中插入Flag标签以及插入EMCV IRES序列的Luc2报告载体两种方式，验证了circAXIN1的翻译。（T系列和R系列circRNA翻译验证载体由广州吉赛生物提供）。

图2. CircAXIN1编码AXIN1-295aa的验证

参考文献：

1.   Circ-MALAT1 Functions as Both an mRNA Translation Brake and a microRNA Sponge to Promote Self-Renewal of Hepatocellular Cancer Stem Cells. Adv Sci (Weinh), 2020. 7(4): p. 1900949.

2. A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression. Mol Cancer .2021 Dec 4;20(1):158.

过表达载体构建及鉴定

以PCR扩增hsa_circ_00AAAA IRES全长***bp序列，以BamHI，EcoRI双酶切连接到Luc2-IRES-Report中。

图1   Luc2-IRES-Report载体图谱

载体测序引物：Luc-seqF: CAGGAGGACGCTCCAGATGA

测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明IRES目的序列成功插入Luc2-IRES-Report中，载体构建成功。

R系列载体活性检测原理简介：

    报告载体质粒转染细胞，检测 F-Luc和R-Luc活性，以F-Luc/R-Luc的值判断序列的IRES活性。