RNase R

RNase R是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。

RNase R是circRNA的鉴定和富集实验必备工具酶，可消化线性RNA以使环形RNA（circRNAs）或套索结构RNA（lariat RNA）得到富集。

应用场景

1. circRNA的鉴定

根据RNase R(+)和RNase R(-)组中是否检测到条带来证明检测的分子是否是circRNA。

图2.RNase R消化后RT-PCR检测Lariat/Circular RNA

在图2中，检测mRNA在RNase R(-)中有条带，在RNase R(+)中无条带；检测Lariat/Circular RNA，在RNase R(-)和RNase R(+)样品中都有条带，表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）。

2. circRNA的富集

高通量测序时常需要对circRNA进行富集，为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化，可以同时做RNase R(+)和RNase R(-)组样品的测序。

图3.RNase R(+)和RNase R(-) RNA测序示意图（Jeck WR et al., 2014）

有研究报道，测序显示RNase R(+)组中Junction Reads相对于RNase R(-)样本有5-10倍的富集，可鉴定出几千到上万个circRNAs（图3）。

3.circRNA的纯化

消除线性RNA残余的干扰，是人工合成高纯度circRNA的关键。高效的RNase R不仅是连接酶法circRNA人工合成的关键工具，在内含子自剪切的circRNA人工合成中也是必不可少的。

图4. 吉赛生物circPrecise™平台制备环状RNA产物（“纯化产物”使用GSPure® RNase R纯化）

产品优势

特异性强：特异性消化线性RNA；

高效快速：5-15min即可消化大部分线性RNA；

Buffer兼容：消化产物可直接用于下游实验；

使用方便：体系简单，37℃一步反应。

质量控制

SDS-PAGE 检测纯度>95%；Total RNA经RNase R消化后进行RT-qPCR检测，线性 RNA丰度明显降低，环形RNA丰度基本不变。

性能比较

1.RNA电泳检测

将10U RNase R加入到2.5 μg Total RNA中，于37℃孵育15 min后直接进行电泳检测，结果显示RNase R(+)组条带变淡（不可见），表明RNase R对Total RNA产生消化作用。吉赛和公司A或公司E的RNase R对Total RNA消化效果相当。

3.RT-qPCR检测

将10U RNase R加入到2.5 μg total RNA中，于37℃孵育30 min后进行RT-qPCR实验，结果显示RNase R+组β-actin和FGFR2的丰度都明显降低，表明RNase R可消化线性RNA。吉赛和公司E的RNase R对线性RNA消化效果相当，优于公司A的RNase R。

案例1：

2022年7月21日，西北大学生命科学学院关锋教授团队在C1GALT1在膀胱癌中的生物功能及其调控机制的研究中取得了新进展，研究结果发表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，题名“Dysregulation and prometastatic function of glycosyltransferase C1GALT1 modulated by cHP1BP3/ miR-1-3p axis in bladder cancer”。

研究团结队使用RNase R（R0301，吉赛生物）检测了7个DEcircRs对RNase R消化的敏感性，以排除可能通过反式剪接、基因组重排或PCR产物产生的头尾剪接。证明DEcircRs对RNase R的抗性均高于GAPDH对照。

案例2：

2022年8月12日，北京大学基础医学院张卫光教授团队在Redox Biology杂志在线发表了题为“CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease”的研究论文。该研究发现circRNA分子 circSV2b在帕金森病（Parkinson's disease，PD）发病过程中发挥着重要作用，并揭示了其作用机制。

研究团结队使用RNase R（R0301，吉赛生物）处理显著降低线性SV2b和β-Actin的mRNA水平，而circSV2b的量未观察到明显的改变，证明circSV2b是一个高度稳定且内含子保留的环状RNA。

[1] IF27.401 A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression. Molecular Cancer

[2] IF15.302 circPARD3 drives malignant progression and chemoresistance of laryngeal squamous cell carcinoma by inhibiting autophagy through the PRKCI-Akt-mTOR pathway. Molecular Cancer

[3] IF15.302 Circular RNA circCORO1C promotes laryngeal squamous cell carcinoma progression by modulating the let-7c-5p/PBX3 axis. Molecular Cancer

[4] IF13.493 The circFASN/miR-33a pathway participates in tacrolimus-induced dysregulation of hepatic triglyceride homeostasis. Signal Transduction and Targeted Therapy

[5] IF12.658 Dysregulation and prometastatic function of glycosyltransferase C1GALT1 modulated by cHP1BP3/ miR-1-3p axis in bladder cancer. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[6] IF11.556 Engineering circular RNA regulators to specifically promote circular RNA production. Theranostics

[7] IF11.492 CircIMMP2L promotes esophageal squamous cell carcinoma malignant progression via CtBP1 nuclear retention dependent epigenetic modification. Clinical and Translational Medicine

[8] IF11.161 Circular RNA circ-MTHFD1L induces HR repair to promote gemcitabine resistance via the miR-615-3p/RPN6 axis in pancreatic ductal adenocarcinoma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[9] IF11.161 Warburg effect-promoted exosomal circ_0072083 releasing up-regulates NANGO expression through multiple pathways and enhances temozolomide resistance in glioma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[10] IF11.161 CircFAM73A promotes the cancer stem cell-like properties of gastric cancer through the miR-490-3p/HMGA2 positive feedback loop and HNRNPK-mediated β-catenin stabilization. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[11] IF11.161 CircAGAP1 promotes tumor progression by sponging miR-15-5p in clear cell renal cell carcinoma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[12] IF10.392 A novel intronic circular RNA, circGNG7, inhibits head and neck squamous cell carcinoma progression by blocking the phosphorylation of heat shock protein 27 at Ser78 and Ser82. Cancer Communications

[13] IF10.122 Lipotoxicity-induced circGlis3 impairs beta cell function and is transmitted by exosomes to promote islet endothelial cell dysfunction. DIABETOLOGIA

[14] IF8.886 circRNA-0002109 promotes glioma malignant progression via modulating the miR-129-5P/EMP2 axis. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[15] IF8.886 HnRNP-L-regulated circCSPP1/miR-520h/EGR1 axis modulates autophagy and promotes progression in prostate cancer. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[16] IF8.886 Effects of long-term culture on the biological characteristics and RNA profiles of human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[17] IF8.886 CircSTK40 contributes to recurrent implantation failure via modulating the HSP90/AKT/FOXO1 axis. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[18] IF8.579 circPTCH1 promotes invasion and metastasis in renal cell carcinoma via regulating miR-485-5p/MMP14 axis. Theranostics

[19] IF8.469 Circular RNA hsa_circ_0043280 inhibits cervical cancer tumor growth and metastasis via miR-203a-3p/PAQR3 axis. Cell Death & Disease

[20] IF8.469 CircHAS2 promotes the proliferation, migration, and invasion of gastric cancer cells by regulating PPM1E mediated by hsa-miR-944. Cell Death & Disease

[21] IF8.469 Autophagy-related circRNA evaluation reveals hsa_circ_0001747 as a potential favorable prognostic factor for biochemical recurrence in patients with prostate cancer. Cell Death & Disease

[22] IF8.469 Circular RNA circACSL1 aggravated myocardial inflammation and myocardial injury by sponging miR-8055 and regulating MAPK14 expression. Cell Death & Disease

[23] IF8.469 Circular RNA circRUNX1 promotes papillary thyroid cancer progression and metastasis by sponging MiR-296-3p and regulating DDHD2 expression. Cell Death & Disease

1.RNase R消化成功的标准？

建议RNA经RNase R消化后取一部分直接进行电泳检测，28、18S条带变淡说明消化成功。（电泳结果比较直接，可观测到消化成功，若不成功就是有问题）

2.RNase R实验怎样设计对照组？

参考下图多几个分组和对照，排除下影响因素。（增加多个对照，可以排除和找出异常情况的原因）

3.RNase R实验的条件？

消化时间和RNase R用量可能需要预实验摸索，找到合适的条件，让线性RNA被消化而 circRNA保持不变。一般37℃消化15min，检测内参的Ct值延后5~10都是比较成功的结果。（考虑消化不够或过头，或者结果数值不好看，可以做预实验摸索）

4.RNase R引物检测的问题？

注意检测引物的特异性问题。注意区分circRNA和mRNA的同源序列。（引物有非特异扩增的时候，检测结果数值完全不可能，任何说消化无效果或效果过头都不可信）

5.CircRNA数量不变，算成功吗？

总RNA被消化后，线性RNA数量减少，circRNA数量基本不变，则其中circRNA的比例增加了，即circRNA被富集了，后面qPCR检测circRNA的丰度有可能会偏高，是正常的。

6. RNase R消化后如何回收RNA？

RNase R消化后消化液如果回收，图方便可以使用Trizol回收，按说明书操作即可。如果不回收直接进行逆转录的，吸取消化液的体积不能超过逆转录体系的1/4，因为消化液中残留的离子等会干扰下游的RT-qPCR反应。例如逆转录是20ul体系，则吸取的RNase R消化液不能超过5ul。

7.RNase R消化不成功怎么办？

使用新的试剂盒或试剂重新提取RNA，保证RNA的纯度和质量。（RNA的纯度高才能消化效率高，酚类等残留会明显影响消化效果，gDNA污染也会减弱消化效果）

8. RNase R如何储存

当天内使用的，RNase R（20U/ul）可以用无酶水稀释，长期使用的，应该用Storage Buffer稀释，配方在说明书里有。(用量少时体积小，有客户想稀释使用)

9.RNase R消化有什么注意事项

配置Nuclease-free的试剂，需要使用Nuclease-free的水、吸头等试剂耗材，或者用DEPC处理过的水，另外实验台面（建议全程超净台内或生物安全柜内）也要用核酸酶清除剂喷雾和擦拭处理，这些都是做RNA实验的配置。

10.RNase R消化的特殊情况

特殊情况：有的线性RNA耐受消化，有的circRNA也容易被消化。

11.RNase R消化后不用纯化，直接跑胶，是否可以？

可以的。还能评估下消化效果，28、18S条带变淡说明消化成功。

另，直接进行RT-PCR的，一般也可以不做纯化，酶失活后直接进行逆转录反应即可。

12.消化反应中RNase R使用多少比较合适？

不同参考文章里RNase R的使用量和反应体系都有差别，最常见的是20 μL反应体系，使用比例为1-4 U RNase R/μg RNA，实验中可能需要摸索调整。

13.RNase R消化反应温度和时间设定多少？

RNase R消化一般于37℃进行反应，一般10-30 min即可消化掉大部分线性 RNA。常用5-15 min消化就能得到很好的结果。

14.RNase R消化反应后要不要灭活？

经RNase R消化后直接进行逆转录反应的，推荐在37℃反应结束后保持70℃ 10 min使RNase R灭活（也有65℃ 15min）。如果消化后要进行纯化回收，也可以不做灭活。

15.RNase R消化鉴定

样本RNase R消化前后取一部分直接进行电泳检测，可直观查看抽提的RNA质量及Rnase R消化效果，28、18S条带变淡说明消化成功。若RNA纯度不高，28S/18S条带可能有凹型拖尾。若RNA有gDNA污染，可能残留gDNA条带。

16.RNase R消化反应条件？

不同的circRNA对RNase R的耐受性不同，具体反应时间需要自行摸索。一般反应时间为10-30 min，不推荐过长时间的消化。个别circRNA耐受RNase R消化力弱。对此，可以减少消化时间。

17.RNase R消化后需要测定产物浓度吗？

不可直接测定RNA浓度，因为反应体系内的蛋白质、盐离子等成分会导致RNA浓度测定不准确。建议先纯化RNA再测定浓度。

18.RNase R消化后产物处理：

直接进行逆转录反应的，推荐RNase R灭活。灭活条件为：70℃保持15min。吸取消化液的体积不能超过逆转录体系的1/4，因为消化液中残留的离子等会干扰下游的RT-qPCR反应。例如逆转录是20ul体系，则吸取的RNase R消化液不能超过5ul。

如果消化后要进行纯化回收，也可以不做酶的失活。