如何从Polysome profiling入手，“拿捏”翻译研究？（含PLUS版攻略）

以上问题均可从RNA翻译的角度切入深究，我们之前已经介绍过各种翻译组分析技术，错过的朋友可以回头看看↓↓

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其中Polysome profiling被广泛应用于翻译研究。历久弥新的Polysome profiling还被称为翻译研究传统的“金标准”。^[1]

翻译过程中，核糖体小亚基（40s）首先与mRNA的5’端结合，并沿5’→3’方向扫描mRNA，直到识别起始密码子。随后，60s核糖体大亚基在这个位置与40s亚基结合，形成具有催化活性的80s核糖体，进而启动肽链延伸及蛋白合成。由于多个核糖体可以同时结合同一条mRNA，因此mRNA上结合的核糖体数量可间接反映翻译活性。相比之下，仅结合单核糖体的RNA通常翻译水平较低或处于翻译停滞状态，而仅结合核糖体亚基的RNA可能尚未启动翻译。

Polysome profiling技术建立于20世纪60年代，根据核糖体结合RNA的翻译特性，结合越多核糖体的RNA沉降系数越大，基于蔗糖梯度超离心，可将细胞质RNA分离成无结合核糖体RNA（游离RNA）、结合40s和60s核糖体亚基、单核糖体（80s）和不同数量多聚核糖体等多个组分。通过分析RNA或蛋白质在不同组分的分布情况，可评估翻译状态，研究翻译调控机制。

Polysome profiling技术路线图。^[1]

①裂解细胞：添加翻译延伸抑制剂，在增殖阶段裂解细胞，分离细胞质裂解液；

②超速离心：把裂解液转移到梯度蔗糖溶液后，超速离心将RNA分离成不同的组分；

③收集组分：利用密度梯度分馏系统，UV吸光度检测核酸浓度并收集各个组分；

④回收产物：从蔗糖溶液组分中回收RNA复合物；

⑤分析产物：绘制核糖体图谱；RT-qPCR分析特定RNA；高通量测序分析全局RNA概况；Western Blot或质谱分析蛋白质。

①高分辨率

Polysome profiling通过分离结合不同数量核糖体的RNA，可区分不同翻译活性的RNA，准确计算RNA的翻译效率（TE）。

通过Polysome profiling计算TE。^[2]

此外，Polysome profiling可作为Disome-seq等技术的预检测环节，查看图谱特定的峰，判断样本质量及是否适合下游检测。

Polysome profiling中呈现双核糖体峰。^[3]

② 动态监测

Polysome profiling体现RNA在各组分的分布变化，可捕捉药物处理、应激、病理等条件下的翻译活性的动态变化。

Polysome profiling分析EDTA处理和未处理的RNA翻译状态，同时研究翻译调控蛋白的分布。^[4]

③ 高兼容性

Polysome profiling下游产物可进行多种检测：高通量测序分析全局翻译状态；RT-qPCR验证不同条件下特定基因的翻译状态；WB/质谱同步验证翻译活性，还可分析翻译调控因子。

④ 高灵活性

Polysome-seq可挖掘潜在翻译的ncRNA，并结合Polysome-qPCR验证翻译活性。从数据库或软件中预测到的潜在翻译ncRNA，也可以利用Polysome profiling+qPCR验证可翻译性，干湿实验结合，性价比更高！

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Polysome profiling验证胶质细胞瘤中circ-SMO的可翻译性。^[5]

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Polysome profiling难吗？不就是蔗糖溶液密度梯度离心吗？

对，但不全对！

① 需要专业设备：Polysome profiling需要用大型超速离心机，离心数小时以保证多个组分的清晰分离；随后的组分检测和收集也需专用的密度梯度分馏系统，包括流量控制的泵以及UV检测器。

② 操作较繁琐：需一系列繁琐的溶液配置、离心、分离、检测等操作步骤，耗时长且对操作者要求较高。

③ 容易受干扰：细胞内普遍存在高分子量的复合物，容易对多聚核糖体收集和检测造成干扰。

①准备足够的样本

每个样本细胞量需≥ 1×10⁷，且确保不同组别的样本细胞量一致。

②做好样本前处理

支原体检测：收集细胞样本（特别是用于测序的样本）做支原体检测，确保无支原体感染；

固定翻译状态：收集细胞前，细胞培养基中加入放线菌酮（cycloheximide），细菌样本需加入氯霉素（chloramphenicol）抑制翻译延伸；

收集细胞：对于贴壁细胞建议用胰酶消化，尽量避免用刮刀刮下细胞，而胰酶中也需加入放线菌酮。

私信公众号后台，发送“polysome”，可获取详细的Polysome profiling样本前处理详细步骤 。

③专业检测

一般实验室较少配备大型超速离心机，因此送专业的机构检测既可解决设备问题，又可解决繁琐且高难度的操作问题。

④合理选择组分

产物测序分析：用于评估全局翻译活性、筛选受翻译调控基因、筛选可翻译基因等。测序所需样本较多，成本较高。因此可以适当合并组分，一般选择一对组分用于对比，如结合多聚核糖体组分（P）vs 无结合多聚核糖体组分（NP）、结合多聚核糖体组分（P）vs无结合核糖体组分（ribosome-free）或结合多聚核糖体组分（P）vs总RNA等。

产物qPCR/WB检测：用于验证阶段，为准确评估RNA在各组分的分布变化，应尽量细分组分，获取足够的数据点，更准确地呈现特定RNA的翻译活性变化。

助力攻克各种翻译研究难题

①根据沉降系数大小，提供沉降系数从小到大共18个分离的组分，可增加RT-qPCR数据点，绘制更详细的翻译动态折线图，更精准反映翻译活性的动态变化；

②增加RNA质控，检测RNA完整性，确保下游的分析:

如送样不均衡，可根据质检结果进行相对等量上机(但不一定准，因为复合物含核酸和核糖体、蛋白等)

③能处理的样本类型增多：包括细胞、组织、细菌、真菌菌体等。

④统计AUC值(P/non-P ratio常用于表征样品整体的翻译活性)

例：

参考资料

[1] Su D, et al. Ribosome profiling: a powerful tool in oncological research. Biomark Res. 2024, 12(1):11.

[2] Kovalski JR, et al. Functional screen identifies RBM42 as a mediator of oncogenic mRNA translation specificity. Nat Cell Biol. 2025 Mar;27(3):518-529.

[3] Zhao T, et al. Disome-seq reveals widespread ribosome collisions that promote cotranslational protein folding. Genome Biol. 2021 Jan 5;22(1):16.

[4] Kovalski JR, et al. Functional screen identifies RBM42 as a mediator of oncogenic mRNA translation specificity. Nat Cell Biol. 2025 Mar;27(3):518-529.

[5] Wu X, et al. A novel protein encoded by circular SMO RNA is essential for Hedgehog signaling activation and glioblastoma tumorigenicity. Genome Biol. 2021;22(1):33.