Nature丨“猎环人”如何应对circRNA研究的各种挑战？

circRNA曾被认为是剪接错误的产物，如今人们知道它在生物体中广泛存在，与癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病等疾病有关，并为治疗药物和生物标志物提供了广泛的可能性，circRNA引起了广大研究者的兴趣。

科学家们仍在研究circRNA的作用：如清除miRNA，以防止miRNA与mRNA结合并抑制蛋白质的产生；与各种蛋白质或RNA聚合酶相互作用，以调节转录和蛋白质表达；甚至可被翻译（图1）。

图1 环状RNA在细胞中有多种潜在功能：靶向RNA、蛋白质或DNA分子。

柏林系统生物学家Nikolaus Rajewsky：“关于circRNA，确实有很多有趣的事情有待发现。这是一个未知而又令人感兴趣的领域。”

circRNA的研究极具挑战。circRNA较罕见，约占非核糖体RNA的0.1%^[1]。circRNA与相同基因转录的线性RNA的唯一区别在于连接成环处（环化位点）。因此，在线性RNA干扰下，难以分析或生成较纯的环状结构。

刚进入circRNA领域的研究人员可参考已发表的最佳研究。美国耶鲁大学Grace Chen建议，最好方法是着手circRNA研究前咨询circRNA领域的“老手”。

Chen：“我认为，如果人们对这个领域感兴趣，就应该努力进入这个领域。这里有很多待发现的东西。”

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挑战：circRNA数据库的选择

比利时根特大学的癌症基因组学研究员Jo Vandesompele团队在2020年审查了circRNA数据库，他警告：有很多数据库都是未经整理的、不完整的，且充斥着未经验证的circRNA；同一个分子有很多名称，数据库概况完全是个噩梦。

因而选择数据库时需留心，Vandesompele会选择来自中国科学院北京生命科学研究院赵方庆团队的circAtlas，因为circAtlas通过两种工具来识别任何列出的circRNA。

挑战：circRNA测序方法的选择

测序是寻找新环状RNA的最常用方法，但circRNA不存在于靶向poly(A)尾构建的标准RNA文库中，因为circRNA缺乏这种特征。美国贝勒医学院的RNA生物学家Jeremy Wilusz说：“你需要专门寻找它们。”

最常见的选择是创建总RNA文库，这比构建circRNA特异性文库更容易，成本更低，且可以检测多种RNA形式，不仅是环状RNA。

另一种方法是去除大部分非环状RNA。需要用RNase R，它可以攻击线性RNA的末端。但Vandesompele警告，注意滴定反应条件很重要，酶太多会破坏circRNA，太少则会残留一些线性片段。此外，某些RNA结构，如G-四联体、组蛋白mRNA和小核RNA，也会阻碍RNase R作用。Wilusz团队报告，将反应缓冲液中的钾换成锂可破坏这些RNA结构，并有助于改善线性RNA的降解^[2]。

挑战：分析工具的选择

Vandesompele称，美国Illumina开发的短读测序结果一般都比较好。RNA测序之后，就需要在这些序列中寻找关键的环化位点。但各种算法在灵敏度上差别很大。

Vandesompele团队在2023年进行的16种工具的比较，单个算法从同一细胞系中识别出1372到58032个circRNA^[3]。Vandesompele建议研究人员至少选择两种假阳性率低的工具。

挑战：测序结果拼接

这些算法都不是完美的， Rajewsky指出：“根据我们的经验，得到的数据中有80%是真实的。”意料之外的拼接形式或放大事件可能会产生虚假的结果。

Vandesompele说，长读测序虽然成本较高，却是另一种很好的选择，只有这样，你才能更精准地识别circRNA。 

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挑战：参考基因组比对

美国斯坦福大学的计算生物学家Julia Salzman说，另一个问题是，大多数搜索算法依赖于将RNA序列与参考基因组比对。如果参考基因组中缺少circRNA序列，可能会产生假阴性结果。如果基因组中可能有接近同源的序列，试图匹配这些序列就可能产生假阳性。

Salzman团队开发了一种名为SPLASH2的替代方法。该软件基于被称为k-mers的短基因片段的计数，可在不依赖参考基因组的情况下比较两组序列。

量化已知circRNA，可使用微阵列芯片，利用核酸探针检测环化位点。Arraystar公司的科学家Yanggu Shi表示，大约70%的微阵列预测是正确的。

通常使用qPCR进一步验证circRNA的存在和环状结构。用RNase R处理样品以降解线性RNA，未经处理的样品作为对照，并扩增两个样品的RNA。真正的circRNA经得起RNase R的处理，而线性的对应物则会被酶切。

挑战：多种类型的circRNA结构检测

环化位点的检测只代表一部分的circRNA，因为可能存在多个环有不同的外显子，甚至内含子共享相同的环化位点。

因而Wilusz的验证策略包括非PCR方法，如Northern blotting，分离不同大小的RNA分子，然后使用序列特异性探针检测感兴趣的分子。这样不仅可检测特定的RNA，还可确定有多少不同大小的分子含有这些序列。

澳大利亚弗林德斯大学分子生物学家Vanessa Conn说，circRNA的丰度可为其功能提供重要线索。例如，如果circRNA可清除miRNA，那么circRNA应该足够丰富，才能捕获细胞中的大多数miRNA。但即使是一种罕见的circRNA也可能影响基因的表达。

挑战：不同大小的circRNA的量化

弗林德斯大学的研究人员说，量化circRNA可能很棘手，因为样本中的小分子比大分子的circRNA扩增更快，使小分子显得更丰富。

为解决这个问题，Conn团队开发一种名为SplintQuant的方法^[4]。通过设计与目标circRNA接头配对的DNA探针，然后用一种酶将发现circRNA的探针对连接在一起，并利用qPCR进行计数。

挑战：不同研究的结果对比

但是如何对比不同实验室和操作流程的circRNA序列和量？

Conn团队合成称为SynCRS的circRNA的形式，将已知量的SynCRS加入到建库前的样品中^[5]，就可将不同实验室的结果标准化。

挑战：circRNA去除和过表达方式

关键的方法包括敲除或过表达circRNA。难度还是在于与circRNA相似其他RNA类型，会把池子搞混，混淆视听。

① circRNA干扰

墨西哥Federico Gómez儿童医院的医学研究员Guillermo Aquino-Jarquin说，RNA干扰技术可靶向环化位点，是常用的技术。也可设计干扰RNA，特异性地结合和抑制怀疑的核酸或蛋白质的结合位点。

另一个选择是使用CRISPR-Cas系统，靶向敲除目标circRNA的基因。但线性RNA的产生也会受到基因组改变的影响。

研究人员也可利用Cas13酶靶向RNA水平上的环化位点或其他结合位点。Aquino-Jarquin说：“这样敲掉circRNA，但没有破坏基因组”。他估计，这种敲除方式的有效性约为80-90%，而RNA干扰的有效性为50-60%。然而，Cas酶也会有脱靶效应。

② circRNA过表达

Wilusz说，对circRNA的验证仍是关键。例如，那些认为circRNA可能吸附miRNA的研究人员，会去除circRNA去寻找结果，这也突变了可能的miRNA结合位点。如果去除一个circRNA会产生一种表型，那么添加这个circRNA应该会逆转。这就是需要过表达的原因。Rajewsky说：“这是可行的，但不可能做到完美。据我所知，无人能生产100%干净的circRNA，因为会引入一些其他RNA。”

Obi称，研究人员可体外合成circRNA，也可设计质粒利用细胞自身剪接机制体内产生circRNA。后者在理想情况下，最真实地再现它在细胞中的产生。另一种经典的方法是排列内含子-外显子（PIE）策略，它包括将外显子和内含子重新排列促进circRNA产生。

Obi说，为了更好地控制circRNA的纯度，实验室的体外合成方法更可取。Obi和Chen更倾向于生成线性RNA前体，然后使用连接酶将其连接。为尽量减少副作用，研究人员可添加RNase R以降解不需要的线性RNA，并使用凝胶电泳或液相色谱等分离技术进行纯化。

③ 验证技术

挑战：功能验证方法是否合适

但Rajewsky警告，合成circRNA，放入的任何东西都是人为的，可能与生命活动完全无关。

因此，关键是用多种技术进行验证。例如，Rajewsky团队最近报道circRNA Cdr1as与miR-7相互作用，调节神经元中神经递质谷氨酸的释放^[6]，其中应用了多种技术：哺乳动物初级神经元培养、化学和电刺激、单细胞RNA成像和miRNA敲除——仅举几例。

Rajewsky：“这是不是有点太过了？对circRNA而言一点都不为过，有必要对这些crazy的分子说些实在的！”

https://www.nature.com/articles/d41586-024-03683-w

[1] Gruner, H., Cortés-López, M., Cooper, D. A., Bauer, M. & Miura, P. Sci. Rep. 6, 38907 (2016).

[2] Xiao, M. S. & Wilusz, J. E. Nucleic Acids Res. 47, 8755-8769 (2019).

[3] Vromman, M. et al. Nature Methods 20, 1159-1169 (2023).

[4] Conn, V. & Conn, S. J. RNA 25, 1202-1210 (2019).

[5] Conn, V. M., Liu, R., Gabryelska, M. & Conn, S. J. Nature Protoc. (2024)

[6] Cerda-Jara, C. A. et al. EMBO Rep. 25, 3008-3039 (2024).