最全！circRNA研究思路/技术

circRNA是由前体RNA通过反向剪接（back-splicing）形成的，无5'-帽和3'-poly (A)尾结构的共价闭环单链RNA。circRNA在病理和生理过程中起重要作用，具有作为生物标记物、治疗靶点和新药物的潜力。此外，circRNA因独特的闭环结构而稳定性更强，作为线性mRNA的有效替代品，是下一代RNA疗法开发的理想平台。因此，circRNA在癌症等多种疾病中的研究备受关注。

circRNA相关研究持续升温，本期就来扒一扒circRNA的研究思路。

一、目的circRNA筛选

① RNA-seq或circRNA-seq（Nanopore circRNA全长测序）分析样本的转录组，筛选特定表型或疾病中表达有明显差异的circRNA；

② 转录组数据联合数据库进行生信分析，得到有潜在研究价值候选circRNA。

图1 circRNA-seq得到热图和散点图结果显示宫颈癌（CC）组织中存在数百个circRNA表达差异。[1]

③ 针对编码circRNA的研究，利用RNA-seq联合翻译组测序Polysome-seq、Ribo-seq及RNC-seq等技术，通过生信分析，可挖掘潜在编码RNA，并预测相应的IRES元件和ORF序列。

图2 Polysome-seq、MeRIP-seq及RIP-seq揭示 circMET是m6A修饰的潜在编码circRNA。[2]

图3 ribo-seq分析人类心脏循环的可翻译circRNA。[3]

图4 RNA-seq联合RNC-seq筛选胶质瘤细胞中差异表达的可翻译circRNA。[4]

相关技术

转录组测序：RNA提取、Nanopore circRNA全长测序、circRNA-seq、RNA-seq、Exosome RNA-seq；

翻译组测序：Polysome-seq、Ribo-seq、RNC-seq；

生物信息学：生物医学大数据挖掘分析、circRNA定制化分析及绘图、常规组学及多组学联合分析、单细胞测序数据生信分析……

二、circRNA表达分析及结构验证

① 内源丰度：RT-qPCR验证候选circRNA在目标样品中的内源丰度。筛选对比样品中表达量有明显差异，且内源丰度合适的circRNA进行下一步验证。

图5 qRT-PCR结果显示，circCCDC134在24个肿瘤组织和10个转移组织和CC细胞中过表达。[1]

② 环状结构：设计circRNA引物进行PCR和Sanger测序，结合RNase R耐受实验鉴定候选分子的环状结构。

图6 鉴定circCORO1C环状结构。B：RT-PCR和Sanger测序验证circCORO1C的反向剪接连接；E：RNase R处理和RT-PCR分析验证FD-LSC-1和TU-177细胞中circCORO1C的稳定性。[5]

③ 作用定位：荧光原位杂交（FISH）或核质分离实验分析候选circRNA的细胞定位。不同定位的circRNA的功能和机制类型可能不同，还会影响后续敲低基因策略的选择。

图7 用Cy3标记的circSPON2探针(红色)进行FISH检测，显示circSPON2在PC-3细胞质中富集。[6]

相关技术

表达量分析：RNA提取、引物合成及验证；

结构鉴定：circRNA成环验证和全长鉴定 、RNase R耐受实验 ；

定位分析：FISH探针设计、荧光原位杂交（FISH）……

三、circRNA细胞功能研究

      在相关细胞进行circRNA功能丧失和功能获得研究。

①过表达：瞬转体外制备的circRNA或circRNA质粒，对于难转染的细胞也可利用腺相关病毒（AAV）感染或利用慢病毒载体构建circRNA过表达稳转细胞株等。

②敲低：瞬转siRNA、ASO、或shRNA载体，对于难转染的细胞也可利用腺相关病毒（AAV）感染或利用病毒载体构建circRNA敲低稳转细胞株等。敲低细胞质富集的circRNA可用siRNA或shRNA，敲低细胞核富集的circRNA可用ASO。

图8 qRT-PCR分析circSTX6敲低和过表达PANC-1和CFPAC-1细胞中circSTX6和线性STX6的表达。[7]

③ 细胞功能实验：CCK8、流式细胞术、划痕、Transwell等实验检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭等，体外验证circRNA的功能。候选circRNA可影响细胞功能，则可进一步研究作用机制；对细胞功能无影响，则考虑重新筛选circRNA。

图9 通过EdU、CCK8、Transwell等细胞实验验证circSTX6的功能。[7]

相关技术

过表达/敲低：circRNA体外合成-LNP包封、circRNA过表达/敲低载体构建及验证、慢病毒（LV）/腺相关病毒（AAV）包装、稳株构建、siRNA/ASO；

细胞功能验证：CCK8、流式细胞术、划痕、Transwell……

四、机制研究

细胞质定位的circRNA可能通过ceRNA（competing endogenous RNAs,内源竞争RNA）、与蛋白互作影响蛋白功能、编码蛋白等机制发挥作用；而细胞核定位的circRNA可能通过与DNA或转录因子互作调控转录。

图10 circRNA发挥功能的一般机制[8]

（1）ceRNA机制miRNA可通过结合mRNA导致基因沉默，而部分circRNA可作为miRNA sponge竞争性吸附miRNA，导致靶mRNA受miRNA的抑制减少，从而调控基因表达。miRNA基因沉默过程中涉及的AGO2是将miRNA加工为成熟的沉默合体（miRISC）的关键蛋白。

① 验证circRNA与miRISC互作：用anti-AGO2抗体进行RIP-qPCR实验，检测AGO2与circRNA的结合。通过标签法体内circRNA pull-down实验，可反向验证circRNA结合AGO2。

图11 采用AGO2和IgG抗体进行RIP检测SW620细胞中AGO2与circHAS2的互作。[9]

② 验证circRNA与miRNA互作：miRNA-seq分析和circBank等数据库预测结果，筛选circRNA互作的候选miRNA。标签法circRNA pull-down实验可同时分析与circRNA结合的miRNA。然后FISH共定位及双荧光素酶实验验证miRNA与circRNA互作。通过转染miRNA mimic或inhibitor，验证miRNA的细胞功能。

图12 双荧光素酶实验研究circEYA3与miR-1294互作。[10]

③ 研究miRNA的靶mRNA：mRNA-seq分析联合生信分析预测结果，筛选miRNA的靶mRNA。通过转染miRNA mimic或inhibitor，研究miRNA与mRNA的表达关系。再通过双荧光素酶实验验证miRNA和mRNA的互作。

图13 A：利用数据库预测miR-1294的靶基因；B-C：转染miR-1294 mimic或inhibitor，qRT-PCR检测c-Myc和SURF4的表达；D-F：双荧光素酶实验验证miR-1294与c-Myc互作。[10]

④ 体外机制验证：挽救实验体外验证circRNA-miRNA-mRNA的相互作用机制。

（2）与蛋白互作影响蛋白功能circRNA可作为支架，或蛋白spong，调节蛋白之间的互作或蛋白的功能。

① circRNA pull-down联合LC-MS/MS和Western Blot可定性或定量分析circRNA互作的蛋白。

图14 探针法circRNA pull-down联合LC-MS/MS和Western Blot分析circCDK13互作的蛋白。[11]

② 利用互作蛋白特异性抗体进行RIP-qPCR反向验证蛋白与circRNA的互作。

图15 RIP验证circCDK13与IGF2BP3之间的相互作用。[12]

③免疫荧光结合荧光原位杂交（IF-FISH）分析circRNA和目标蛋白的共定位，指示其互作的可能性。

图16 IF-FISH检测显示circACTN4与FUBP1在乳腺癌细胞核中共定位。[12]

④ Co-IP实验可研究circRNA是否影响蛋白之间相互作用。⑤ 细胞实验体外验证circRNA-蛋白互作机制。

（3）编码蛋白     

circRNA曾被认为是“非编码RNA”，后来陆续有研究证明circRNA可编码多肽或蛋白，并发挥特定的功能。

①翻译功能Polysome-seq、Ribo-seq或RNC-seq联合生信分析可预测有翻译或编码可能性的circRNA及其ORF和IRES元件。构建T系列载体，可进一步验证circRNA的翻译能力。Polysome profiling可分析circRNA的翻译效率的影响因素。

图17 构建T系列载体，验证circCAPG的编码潜能。[13]

② 翻译产物利用标签抗体或制备特异性抗体IP得到翻译产物，采用灵敏且快速扫描的LC-MS/MS进行检测，并用Western Blot技术进行验证，定性/定量分析翻译的产物。

图18 利用 FLAG抗体进行IP，质谱检测circCAPG-FLAG中CAPG-171aa，并分析其氨基酸序列。[13]

③ 翻译机制典型IRES元件介导：构建R系列载体，验证目的circRNA翻译是否为典型IRES元件介导，并验证IRES元件的活性。

图19 构建R系列载体，验证circCAPG的IRES活性。[14]

m6A甲基化修饰介导：MeRIP实验可分析目的circRNA是否存在m6A甲基化修饰。RIP实验可分析与m6A甲基化修饰相关蛋白与目的circRNA的互作。通过干扰或过表达m6A甲基化修饰相关蛋白，研究m6A甲基化修饰与目的circRNA翻译的关系。

图20 根据MeRIP-seq结果研究m6A介导circRNA翻译。[15]

④ 翻译产物功能：在细胞中过表达circRNA、翻译产物及相关突变体，细胞实验验证circRNA或翻译产物的功能。

（4）调控转录

① circRNA pull-down和RIP实验可分析circRNA与转录相关蛋白的相互作用。

② Co-IP实验结合circRNA的功能获得或丧失实验，可分析circRNA是否促进转录相关蛋白之间的互作。

③ 利用转录因子抗体进行ChIP-seq，结合数据库预测结果可筛选调控转录的靶基因。

④ 双荧光素酶报告检测实验结合挽救实验，可进一步验证circRNA-转录相关蛋白-靶基因DNA之间的相互调控作用。

图21 CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7转录。A-C：利用ChIP-seq对FRH0201细胞中YBX1结合区域的全基因组分布进行分析；D：联合RNA-seq和ChIP-seq结果得到靶基因FZD7和LRP1；E：ChIP-qPCR检测FRH0201细胞中FZD7启动子TSS - 1200 ~ - 800 bp区域YBX1富集增加。[16]

相关技术

分子互作：RIP、RNA pull-down（标签法/探针法）、荧光素酶报告检测、Co-IP、ChIP；

关联基因分析：mRNA-seq、RNA-seq、miRNA-seq；

机制验证：miRNA mimic/inhibitor、FISH/IF-FISH、Polysome/Ribo/RNC-seq、T系列载体-RNA翻译研究、Polysome profiling、R系列载体-IRES活性检测、IP-MS、MeRIP-seq……

五、体外验证

建立动物模型，将体外制备的LNP-circRNA或病毒载体递送动物体内，验证circRNA在体内的功能，对生理或病理的调控作用。

图22 动物模型验证CircSTX6在体内的作用。[7]

相关技术

过表达/敲低：circRNA体外合成-LNP包封、circRNA过表达/敲低载体构建及验证、慢病毒（LV）/腺相关病毒（AAV）包装、稳株构建；动物实验：动物模型构建、病理实验、蛋白组研究、代谢组研究……

吉赛生物是引领circRNA科学研究与应用转化的先行者，聚焦circRNA细分领域十余年，依托强大的原研开发能力，建立合成生物学、分子生物学、测序质谱、生信分析等多个技术平台，可为广大科研人员提供circRNA研究相关试剂盒产品和技术服务，以及全流程的circRNA研究解决方案。

案例文献

[1] Liang L et al. ALKBH5-mediated m6A modification of circCCDC134 facilitates cervical cancer metastasis by enhancing HIF1A transcription. J Exp Clin Cancer Res. 2022, 41(1):261.

[2] Zhong J, et al. Circular RNA encoded MET variant promotes glioblastoma tumorigenesis. Nat Commun. 2023, 14(1):4467.[3] van Heesch S et al. The Translational Landscape of the Human Heart. Cell. 2019, 178(1):242-260.e29.[4] Zhang M et al. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun. 2018 , 9(1):4475.[5] Wu Y et al. Circular RNA circCORO1C promotes laryngeal squamous cell carcinoma progression by modulating the let-7c-5p/PBX3 axis. Mol Cancer. 2020, 19(1):99.[6] Yao B et al. The circSPON2/miR-331-3p axis regulates PRMT5, an epigenetic regulator of CAMK2N1 transcription and prostate cancer progression. Mol Cancer. 2022, 21(1):119.[7] Meng L et al. CircSTX6 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma progression by sponging miR-449b-5p and interacting with CUL2. Mol Cancer. 2022, 21(1):121.[8] Kristensen LS et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019, 20(11):675-691.[9] Li H et al. CircHAS2 activates CCNE2 to promote cell proliferation and sensitizes the response of colorectal cancer to anlotinib. Mol Cancer. 2024, 23(1):59.[10] Rong Z et al. Circular RNA CircEYA3 induces energy production to promote pancreatic ductal adenocarcinoma progression through the miR-1294/c-Myc axis. Mol Cancer. 2021, 20(1):106.[11] Huang Q et al. circCDK13-loaded small extracellular vesicles accelerate healing in preclinical diabetic wound models. Nat Commun. 2024, 15(1):3904.[12] Wang X et al. The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC. Mol Cancer. 2021, 20(1):91.[13] Song R, et al. A novel polypeptide CAPG-171aa encoded by circCAPG plays a critical role in triple-negative breast cancer. Mol Cancer. 2023, 22(1):104.[14] Chen R, et al. CircTmeff1 Promotes Muscle Atrophy by Interacting with TDP-43 and Encoding A Novel TMEFF1-339aa Protein. Adv Sci (Weinh). 2023, 10(17):e2206732.[15] Yang Y, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res. 2017, 27(5):626-641.[16] Chen Q et al. Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription. J Hepatol. 2022, 76(1):135-147.