收藏！翻译组研究技术全览：Polysome/Ribo/RNC/Disome-seq

根据中心法则，DNA是遗传信息的载体，蛋白质是生物活动的主要执行者。蛋白表达丰度受RNA合成（转录）、RNA降解（转录后）、蛋白质合成（翻译）和降解（翻译后）等多个过程的影响。

RNA翻译蛋白过程连接转录组和蛋白质组，极消耗能量，因而受严密的调控，以节省细胞资源，并避免毒性蛋白质的产生。

翻译速率可决定蛋白质的折叠构象、定位与功能、产量及对应的细胞表型。蛋白质合成(翻译)速率与最终蛋白质丰度的相关性较高，翻译速率对蛋白质水平的贡献最大。因此，翻译组研究是分析基因表达和调控水平的重要环节。

更重要的是，近年来陆续有研究发现，曾被认为非编码的RNA（ncRNA）可编码或翻译蛋白，而翻译组分析可精准可视化研究编码全新隐秘多肽的ncRNA（如circRNA、lncRNA）。

翻译组研究技术

01 多聚核糖体图谱分析（Polysome profiling）——传统的“黄金标准”

Polysome profiling技术是基于蔗糖浓度梯度溶液超离心，将细胞质RNA分离成多个组分：游离RNA，结合核糖体40S或60 S亚基、单核糖体(80S亚基)或多聚核糖体等。一条翻译的mRNA可同时结合多个核糖体，结合核糖体组分的RNA与总胞质RNA的比例可以间接反映翻译水平。

Polysome profiling步骤

① 裂解：添加延伸抑制剂，以防止核糖体脱离mRNA，在增殖阶段裂解细胞，从总细胞裂解物中分离细胞质组分；

② 超离：将细胞质裂解液加到蔗糖梯度溶液中，超速离心将RNA分离成不同密度的组分；

③ 组分分离：将离心后的样品紫外线(UV)检测器的专用仪器上，并与密度梯度溶液制备和收集系统等分离系统耦合，分离并获得各个组分；

④ 提取RNA：从蔗糖组分中回收RNA；

⑤ 组分分析

●针对单一或几个目标RNA利用RT-qPCR分析各组分的目标RNA分布；

●利用Western Blot或质谱研究必需的翻译蛋白调节因子；

●从分离得到的组分中，选取感兴趣的组分，通过高通量的RNA-seq分析基因组规模的翻译（扩展为Polysome-seq技术）。

图1 Polysome Profiling技术路线图。[1]

Polysome profiling技术优势

① 直观反映细胞和组织内的翻译状态；

② 对胞质RNA翻译水平分级，可针对感兴趣组分进一步分析不同的翻译机制；③ 结合高通量测序可全面、精准、高通量反映翻译组概况。

Polysome profiling技术局限

① 需专门设备在常规实验室可能无法获得；② 需要样本量较大，因为在样品分离过程中，从多个蔗糖组分中合格RNA的回收率较低。

02 核糖体印迹测序（Ribo-seq）——更详细地分析翻译的强大工具

Ribo-seq可获得核糖体沿着翻译mRNA的精确位置，从而得到详细翻译事件的直接证据，可在密码子分辨率上进行全翻译组检测。

Ribo-seq步骤

① 使用延长抑制剂阻止核糖体移位，然后收取细胞;

② 用RNase消化细胞裂解物，裸露的RNA片段打断，而核糖体保护RNA片段得以保留。③ 去除干扰的rRNA，去除核糖体，收集核糖体保护片段(RPF)，也称为核糖体足迹;④ 建库，针对RPF深度测序并分析获取的核糖体足迹数据。

Ribo-seq技术优势

① 提供精确而丰富的核糖体位置信息，可更详细分析翻译调控事件，包括翻译起始、延伸、停止和终止或非常规的翻译事件，如非AUG介导的翻译起始、停止密码子读取、以及翻译新的小开放阅读框(sORF)，或以前被认为是非编码RNA (ncRNAs)的非典型可翻译RNA。

② 可瞬时捕获翻译过程的状态，定量分析翻译效率，对研究翻译调控动态变化具有重要意义。③ Ribo-seq可同时捕获大量基因的翻译活动，为构建全局性翻译提供可能，结合RNA-seq，可系统研究基因表达与翻译调控之间的关系。

Ribo-seq技术局限

① 细胞中不同的mRNA的核糖体延伸率不同，无法区分翻译活跃的核糖体和停滞状态的核糖体，可能导致翻译效率的偏差；

② 小RNA片段(如调控性非编码RNA)的污染可能导致翻译组数据的误解；③ 核糖体的构象、不适当的核酸酶酶切和特定的RNA二级结构，都可能影响足迹长度。

03 核糖体-新生体-链复合体测序（RNC-seq）——全长翻译mRNA测序

RNC-seq技术分离出核糖体结合RNA进行高通量测序，不经过RNase处理，保留RNA全长信息。

RNC-seq技术优势

① 实验操作较简便；② 较长的片段建库，排除了潜在的污染物(如调控性小RNA)；③ 长片段更可能跨越mRNA和circRNA的剪接位点，检测更多的选择性剪接(AS)异构体或翻译circRNA；④ 与RNA-seq结合使用，可通过计算翻译比率(TR，某一基因的翻译RNA丰度与总RNA量之比)，评估哪些mRNA剪接变体在全基因组范围内翻译。

RNC-seq技术局限

①RNC RNA易降解；

②一个或多个核糖体结合的翻译RNA分子被统一分析，而不是像polysome Profiling分成多个组分进行分析，翻译效率分析准确性较低；③若无合适计算分析，RNC-seq由于丢失了翻译RNA上核糖体的位置信息，而无法精确定义非常规ORF的位置，只能为非规范ORF的翻译提供间接证据。

04 双核糖体测序（Disome-seq）——翻译调控研究新技术

停滞的核糖体(stalled ribosomes)是指在翻译过程中暂时停止或显著放慢移动的核糖体。核糖体停滞可能由于多种原因，包括罕见密码子的存在、mRNA的超二级结构、损坏的mRNA或特定的结合蛋白质的存在，直接导致异常蛋白的合成或核糖体的缺乏，从而调控翻译。核糖体碰撞形成的串联双核糖体，可介导共翻译事件，对细胞稳态具有重要作用。

Disome-seq是基于Ribo-seq发展的技术，通过分离核糖体-RNA复合物，用RNase进行酶切消化，裸露的RNA被酶切，而核糖体保护的RNA得以保留。然后分离纯化得到双核糖体保护的RNA片段，进行建库测序。

Disome-seq具有Ribo-seq技术的优势的同时，可针对双核糖体碰撞发生的RNA进行分析，有利于研究共翻译等特殊翻译调控机制。

翻译组研究技术对比

Polysome profiling侧重准确研究翻译效率；

Ribo-seq侧重研究RNA的翻译机制、翻译起始和终止位点及ORF；

RNC-seq侧重研究翻译复合物的组成和活性，以及挖掘潜在可翻译的非典型RNA；

Disome-seq针对双核糖体或核糖体碰撞事件研究特定的翻译调控机制。

其中，Ribo-seq和RNC-seq实际上是从两个不同的方面评估RNA翻译，两者不能相互替代。

Ploysome profiling的“扩展包技术”Polysome-seq，既保留了较长的RNA片段信息（具有RNC-seq的优势），又对核糖体-RNA复合物进行密度分级，更方便挖掘潜在的翻译“ncRNA”，同时可以得到较准确的翻译效率，研究独特的翻译调控机制，是目前研究翻译组的热门技术。

吉赛生物可提供Ploysome profiling、Ribo-seq和RNC-seq一系列经典翻译组研究技术服务，还可提供Polysome-seq和Disome-seq，可根据个性化需求选取不同、单/多个分离组分进行建库测序。翻译组研究无烦恼！

吉赛Polysome-seq系列技术服务项目

参考资料

[1] Su D, et al. Ribosome profiling: a powerful tool in oncological research. Biomark Res. 2024, 12(1):11.