环状RNA新应用：有效促进细胞工程和基因组/表观基因组工程

撰文：EP

编辑：circRNA

排版：Siuyee

研究背景

RNA疗法已经发展成为一种强大的治疗策略，然而其较短的半衰期限制了效用。RNA环化可抵抗核酸外切酶介导的降解，被认为是一种减缓RNA降解的有前景的方法。环状RNA（cRNA）的生产通常涉及RNaseR富集和高效液相色谱（HPLC）纯化，以减少体外转录（IVT）过程中产生的双链RNA引发的免疫反应，因此产量较低（通常低于输入RNA的1%）。cRNA的高效生产和纯化方法，一定程度上限制了其更广泛的应用。

通过cRNA实现的用途涉及与免疫系统的相互作用。已有不少cRNA表达抗原诱导免疫应答用于疫苗开发的研究。然而，基于cRNA靶向基因组和表观基因组的疗法中，免疫反应可能会抑制治疗效果。因此，去免疫是一个更难解决的问题，尤其是在cRNA递送非人源蛋白的情况下。

近日，美国加州大学Prashant Mali研究团队在Nat Biomed Eng杂志上发表研究论文：Robust genome and cell engineering via in vitro and in situ circularized RNAs。论文阐述了研究团队开发的两种RNA环化方法:利用II组内含子体外制备cRNA (ocRNA)，以及使用内源性普遍表达的RtcB蛋白在细胞内环化生成cRNA (icRNA)。研究还证实了cRNA可应用于干细胞工程以及通过锌指(ZF)蛋白和CRISPR-Cas9系统实现强大的靶向基因组和表观基因组作用。

一、 制备ocRNA和icRNA

研究采用来自破伤风梭菌的II型内含子，并添加侧翼扭转核酶改善远程相互作用，体外制备ocRNA。通过Sanger测序检测外显子结合位点（EBS）之间的26nt剪接痕，证实了RNA环化。进一步分析环化产物实现环化效率在70%左右，纯化后产率60%。（图1）

此外，研究通过加入在目的序列上IRES和有效负载的两侧使用扭转核酶，转录出线性RNA，递送进细胞后，在普遍存在的细胞内源性RNA连接酶RtcB作用下，线性RNA连接5 '和3 '端，实现原位环化。icRNA环化水平~20%，随时间推移比例增加，且cRNA表达的GFP比线性原位环状化缺陷RNA (icdRNAs)的持久。（图1）

图1 制备ocRNA和icRNA

二、工程改进cRNA的翻译

研究筛选了19个天然存在和合成的IRES序列，发现脑心肌炎病毒IRES（EMCV）和柯萨奇病毒B3 IRES介导cRNA翻译效果最好，因此加入EMCV IRES元件及有助改善翻译的3’UTR和poly(A) stretch重新设计cRNA，以提高cRNA的翻译效率。（图2）

三、开发简易的cRNA纯化方案

为寻求使用更简单和更经济的纯化方法，在icRNA IVT过程中加入尿素作为变性剂，减少通过T7聚合酶转录所固有的高度免疫原性和dsRNA产生；对于ocRNA，因为在添加变性剂后，剪接的关键二级结构被取消，因此，依赖纤维素色谱法选择性去除长度超过30 bp的dsRNA(长于cRNAs中关键的IRES二级结构)。纯化后的icRNA和ocRNA表现出轻微的免疫反应，ocRNA诱导的免疫翻译几乎无法检测到。虽然HPLC纯化是临床翻译的首选方法，但上述cRNA纯化方法为大多数体外和体内应用提供了可行的替代方法。（图2）

图2 ocRNA和icRNA的优化与表征。

四、cRNA的功能表征

利用干细胞来源的神经元细胞和心肌细胞验证cRNA的表达，结果发现与编码GFP的线性RNA相比，cRNA表达明显更持久。进一步结果表明，潜在细胞内容物的表达取决于IRES活性和/或对非分裂细胞的偏好，与分裂细胞相比，非分裂细胞在转染后不会迅速稀释RNA水平。H1人类多能干细胞(hPSCs)中单次转染NEUROD1 cRNA，可在1周内分化为神经元，这证明了干细胞向非分裂细胞的分化，可以更好地利用持久icRNA提供的高表达的蛋白质积累。（图2-3）

研究进一步制备icRNA或icdRNA的脂质纳米颗粒(LNPs)，眼球后静脉注射到小鼠体内，结果表明icRNA可在体内原位环化，cRNA在小鼠体内至少可持续表达7天，而线性mRNA在第7天后大部分降解。

图3 评估ocRNA和icRNA的持久性和活性。

五、cRNA递送ZF蛋白实现基因组和表观基因组工程

除了持续转基因表达的应用之外，cRNA还可能促进有效靶向基因组，特别是表观基因组的应用。ZF蛋白作为一种完全基于蛋白质的基因组工程，特别适合cRNA这种持续的传递模式。研究证明，锌指核酸酶(ZFN) icRNAs确实可以进行更有效的基因组编辑。（图4）

PCSK9的功能缺失突变与心血管疾病风险降低相关。研究在HeLa细胞中筛选出16个靶向hPCSK9转录起始位点，有效抑制基因表达的ZF-KRAB蛋白模块；利用cRNA融合表达3A3L DNA甲基转移酶和ZF-KRAB蛋白模块，在12天内有效抑制了PCSK9的表达；利用cRNA递送ZF瞬时表达表观基因组调控子，可以实现强效的基因抑制，从而实现无基因组疤痕且安全的方法调节治疗性基因表达。（图4）

图4 icRNA和ocRNA在ZF介导的基因组和表观基因组靶向中的应用

六、通过cRNAs递送去免疫CRISPR-Cas实现基因组和表观基因组工程

因为CRISPR系统来自原核生物，cRNA的持久性表达特征可能会加剧CRISPR系统在治疗环境中的免疫反应。因此，在维持cRNA持久性表达的情况下，有必要通过组合突变，尤其是突变具有免疫原性的表位，筛选去免疫Cas9蛋白。研究开发了一种能筛选百万个基因的LORAX蛋白工程方法，在自然环境中检测核苷酸多态性(SNPs)，筛选突变文库。研究最终结合netMHC表位预测软件对免疫原性的评估，确定导致免疫原性表位去免疫的最有效候选突变。（图5）

然后，利用长读Nanopore测序检测组合突变文库的筛选结果，Nanopore测序很好地规避了短读测序的限制，对整个目标基因进行单分子测序，使文库设计策略能够覆盖分子的全长区域。最后，研究经过一系列的筛选和验证得到功能正常的去免疫Cas9。（图5）

图5  LORAX蛋白工程方法筛选去免疫Cas9变异体。

研究将WT SpCas9或突变体SpCas9v4的icRNA，以及靶向AAVS1的sgRNA转染到HEK293Ts中，成功编辑AAVS1基因组；将WT型dSpCas9或突变型dSpCas9v4 CRISPRoff的icRNA和ocRNA以及靶向B2M基因的sgRNA转染到HEK293Ts中，证实了对B2M基因的抑制作用。通过测试分析发现，体外环化的ocRNA对SpCas9和CRISPRoff插入序列的环化效率分别约为40%和20%。研究通过RNA-seq证实了SpCas9v4和SpCas9在该实验中具有相当的特异性。（图6）

图6 LORAX筛选验证鉴定出Cas9去免疫变异体，以及通过icRNA和ocRNA递送靶向基因组和表观基因组作用。

总结

研究开发了利用II型内含子体外环化cRNAs，还通过内源表达的RtcB蛋白进行细胞内原位环化产生cRNA。此外，研究开发了无高效液相色谱纯化方案，使cRNA高产量，且保持低免疫反应。由此产生的cRNA简单和可扩展地促进了干细胞工程，以及通过ZF蛋白和CRISPR-Cas9系统进行强大的靶向基因组和表观基因组的一系列应用。特别是，携带EMCV IRES的icRNA和ocRNA在心肌细胞和神经元中表现出强大的表达(与线性加帽和修饰的RNA相比)，并且延长了RNA的持久性，强调了cRNA在非分裂细胞中的巨大前景和效用。此外，研究团队的环化策略允许高效地生成和递送大分子蛋白，如Cas9和CRISPRoff，有效解决慢病毒和腺相关病毒包装限制的问题。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41551-024-01245-z