生物学研究常需要调控特定基因的表达,其中下调特定基因表达的技术包括针对DNA水平的基因敲除(如CRISPR-Cas9、TALEN)、针对RNA水平的RNA干扰或反义核酸等。
CPISPR和TALEN都是通过引导核酸酶切割基因组的特定靶位点,经过细胞机制低效修复切口,导致永久性突变,从而使目的基因功能缺失。
而针对RNA水平的敲低技术不会引起基因组DNA序列的变化,在细胞实验中能产生较均一的效果,且方法较为便捷,在基础研究中也较为常用。本文主要介绍RNA水平的基因表达下调技术。
1、RNAi
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导细胞内RNA特异性降解,从而导致靶基因表达沉默,产生相应功能或表型缺失的现象。合成siRNA(小干扰核糖核酸,small interfering RNA)或构建shRNA(短发夹RNA,short hairpin RNA)载体,递送至细胞内,可诱导序列特异的目标基因沉默,迅速阻碍基因的表达活性。
siRNA和shRNA结构
shRNA:茎环结构的RNA,具有两个短的完全反向互补序列(茎)和连接它们的环状区域,长约19-25nt。实际应用中,通常会构建shRNA载体,递送至细胞中发挥作用。
图1 shRNA的结构
siRNA:双链RNA分子,双链分别被称为客链(正义链)和引导链(反义链),其双链3’端各有两个突出的游离碱基,5’端各有磷酸基团,长约21-23nt。
图2 siRNA的结构
RNAi作用机制
shRNA加工:慢病毒转染shRNA可被随机整合到基因组中,常规转染shRNA质粒以游离状态存在靶细胞核中。基因组或外源质粒转录pri-shRNA,经过Drosha/DGCR8酶复合体加工成pre-shRNA,然后通过核输出蛋白Exportin-5转运到细胞质。在细胞质中,pre-shRNA被Dicer和TRBP/PACT酶切加工,去除发夹“环”结构,产生3’端突出2nt游离碱基的双链siRNA。然后装载到沉默复合体(RISC)上。
siRNA形式导入细胞:直接进入细胞的siRNA会在细胞核短暂停留,然后扩散到细胞质中,被装载到RISC上。
降解mRNA:沉默复合体(RISC)核心是siRNA和Argonaute-2(Ago-2),通常还会有其它辅助功能蛋白质。Dicer-siRNA复合物装载到RISC上,siRNA客链被去除,siRNA引导链根据碱基互补配对原则,特异性结合靶RNA,利用Ago-2降解靶RNA,达到干扰基因表达的效果。
图3 siRNA介导的RNA干扰途径示意图[1]
图4 shRNA介导的RNA干扰途径示意图[1]
siRNA vs shRNA
在细胞中,shRNA可加工生成siRNA,类似鸡蛋和荷包蛋的关系。母鸡(shRNA载体)下鸡蛋(shRNA),鸡蛋(shRNA)剥壳加工为成熟的荷包蛋(siRNA)。除了自己动手,也可以直接外卖荷包蛋(siRNA)。无论是DIY还是外卖的荷包蛋,吃了一样能填饱肚子!
那么,世纪难题来了,自己动手or叫外卖?shRNA还是siRNA?
Or...列一下pros and cons吧~
① 外卖(siRNA)比较方便
相比需要构建载体的shRNA,siRNA一般为化学合成,制备更容易且更快捷。
② 外卖(siRNA)比较快
相比在细胞中进行转录和一系列加工步骤的shRNA,siRNA导入细胞后起效更快。
③母鸡(shRNA载体)持续下蛋(shRNA),可长期吃到荷包蛋(siRNA)
siRNA稳定性较低,进入细胞后会逐渐被降解,只能短期内起效(1周左右);而shRNA载体可在细胞中持续转录,效期更长,还可利用慢病毒构建稳转细胞株,持续稳定敲低靶基因。
④DIY更符合自己口味
对于某些难转染的细胞,siRNA转染效率低,而shRNA可借助病毒导入细胞,效率更高;病毒包装后的shRNA更方便用于动物造模等用途。
⑤留得母鸡(shRNA载体)在,哪怕没蛋(siRNA)吃
siRNA的降解可能导致脱靶,降低敲低效率;而整合到基因组或游离质粒的shRNA持续产生siRNA,维持敲低效率。
2、反义寡核苷酸(anti-sense oligonucleotides,ASO)
反义寡核苷酸(anti-sense oligonucleotides,ASO)是通过碱基配对原则与靶RNA特异性结合,从而调控RNA功能的短单链核酸聚合物,通常为12-30个碱基组成的RNA或DNA。根据ASO设计的靶向位置、靶向对象、化学修饰的不同,能发挥不同作用。
ASO降解RNA机制
①Gapmer phosphorioate (PS) ASOs可通过RNase H1触发RNA的降解。Nase H1是一种内源性核酸酶,促进RNA-DNA异源双链中RNA的断裂。在哺乳动物细胞中,RNase H1存在于细胞核、线粒体和细胞质中,可以清除Okazaki片段中的RNA、DNA修复和R环的分解。
②ASO可被设计成诱导Ago-2介导的RNA降解,称为单链siRNA,类似于双链siRNA的机制。
③ASO可作用于pre-mRNA触发可变剪接,产生含有提前终止密码子(PTC)的mRNA, 导致无义介导的mRNA衰变(NMD)。
④ ASO可作用于成熟mRNA触发No-go衰变。
⑤ ASO作用于成熟mRNA,也可阻断核糖体扫描并阻止翻译,导致蛋白质水平降低。
⑥ASO可结合到mRNA的5’UTR,从而抑制翻译起始因子的结合,或引导帽结构的切割,从而抑制翻译。
⑦ 可以结合参与降解和聚腺苷化的pre-mRNA序列,改变聚腺苷化位点,调节mRNA的稳定性和水平。
图5 ASO在RNA水平下调基因表达的机制[2]
ASO化学修饰
引入不同的化学修饰可提高ASO效力、稳定性和靶标亲和力。未修饰的ASO在体内极易被核酸酶降解,磷硫酸酯(PS)和磷酸二酰胺吗啉低聚物(PMO)的修饰可降低ASO的降解风险,且PS修饰的ASO部分具有亲脂性,能促进ASO进入细胞或组织。糖修饰可增强与靶RNA结合的亲和力,减少非特异性脱靶效应,影响核酸酶的稳定性等。LNA修饰,也可增强结合亲和力、序列特异性、热稳定性和核酸酶抗性。2’-MOE和PS 2’-cEt修饰可以增强核酸酶的稳定性和对靶RNA的亲和力。GalNAc偶联修饰,可靶向唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)并增强PS ASOs向肝细胞的递送。
图6 ASO的化学修饰[2]
ASO vs siRNA
相比siRNA,ASO最大的优势在于可以设计根据不同途径调控基因的表达,设计不同化学修饰调整其靶向性和效用,而且ASO在细胞核核细胞质都可以发挥作用。当需要作用于细胞核内的RNA,若所研究的RNA(如lncRNA)在细胞核内发挥作用,或者希望影响pre-mRNA的功能,此时就可以考虑使用ASO。
固体培养基上典型的支原体菌落,具有“煎蛋”形态[2]
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参考资料
[1] Rao DD, Vorhies JS, Senzer N, Nemunaitis J. siRNA vs. shRNA: similarities and differences. Adv Drug Deliv Rev. 2009, 61(9):746-59.
[2] Crooke ST, Baker BF, Crooke RM, Liang XH. Antisense technology: an overview and prospectus. Nat Rev Drug Discov. 2021, 20(6):427-453.