敲低基因用shRNA、siRNA还是ASO？

生物学研究常需要调控特定基因的表达，其中下调特定基因表达的技术包括针对DNA水平的基因敲除（如CRISPR-Cas9、TALEN）、针对RNA水平的RNA干扰或反义核酸等。

CPISPR和TALEN都是通过引导核酸酶切割基因组的特定靶位点，经过细胞机制低效修复切口，导致永久性突变，从而使目的基因功能缺失。

而针对RNA水平的敲低技术不会引起基因组DNA序列的变化，在细胞实验中能产生较均一的效果，且方法较为便捷，在基础研究中也较为常用。本文主要介绍RNA水平的基因表达下调技术。

1、RNAi

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导细胞内RNA特异性降解，从而导致靶基因表达沉默，产生相应功能或表型缺失的现象。合成siRNA（小干扰核糖核酸，small interfering RNA）或构建shRNA（短发夹RNA，short hairpin RNA）载体，递送至细胞内，可诱导序列特异的目标基因沉默，迅速阻碍基因的表达活性。

siRNA和shRNA结构

shRNA：茎环结构的RNA，具有两个短的完全反向互补序列（茎）和连接它们的环状区域，长约19-25nt。实际应用中，通常会构建shRNA载体，递送至细胞中发挥作用。

图1 shRNA的结构

siRNA：双链RNA分子，双链分别被称为客链（正义链）和引导链(反义链)，其双链3’端各有两个突出的游离碱基，5’端各有磷酸基团，长约21-23nt。

图2 siRNA的结构

RNAi作用机制

shRNA加工：慢病毒转染shRNA可被随机整合到基因组中，常规转染shRNA质粒以游离状态存在靶细胞核中。基因组或外源质粒转录pri-shRNA，经过Drosha/DGCR8酶复合体加工成pre-shRNA，然后通过核输出蛋白Exportin-5转运到细胞质。在细胞质中，pre-shRNA被Dicer和TRBP/PACT酶切加工，去除发夹“环”结构，产生3’端突出2nt游离碱基的双链siRNA。然后装载到沉默复合体（RISC）上。

siRNA形式导入细胞：直接进入细胞的siRNA会在细胞核短暂停留，然后扩散到细胞质中，被装载到RISC上。

降解mRNA：沉默复合体（RISC）核心是siRNA和Argonaute-2（Ago-2）,通常还会有其它辅助功能蛋白质。Dicer-siRNA复合物装载到RISC上，siRNA客链被去除，siRNA引导链根据碱基互补配对原则，特异性结合靶RNA，利用Ago-2降解靶RNA，达到干扰基因表达的效果。

图3 siRNA介导的RNA干扰途径示意图[1]

图4 shRNA介导的RNA干扰途径示意图[1]

siRNA vs shRNA

在细胞中，shRNA可加工生成siRNA，类似鸡蛋和荷包蛋的关系。母鸡（shRNA载体）下鸡蛋（shRNA），鸡蛋（shRNA）剥壳加工为成熟的荷包蛋（siRNA）。除了自己动手，也可以直接外卖荷包蛋（siRNA）。无论是DIY还是外卖的荷包蛋，吃了一样能填饱肚子！

那么，世纪难题来了，自己动手or叫外卖？shRNA还是siRNA？

Or...列一下pros and cons吧~

① 外卖（siRNA）比较方便

相比需要构建载体的shRNA，siRNA一般为化学合成，制备更容易且更快捷。

② 外卖（siRNA）比较快

相比在细胞中进行转录和一系列加工步骤的shRNA，siRNA导入细胞后起效更快。

③母鸡（shRNA载体）持续下蛋（shRNA），可长期吃到荷包蛋（siRNA）

siRNA稳定性较低，进入细胞后会逐渐被降解，只能短期内起效（1周左右）；而shRNA载体可在细胞中持续转录，效期更长，还可利用慢病毒构建稳转细胞株，持续稳定敲低靶基因。

④DIY更符合自己口味

对于某些难转染的细胞，siRNA转染效率低，而shRNA可借助病毒导入细胞，效率更高；病毒包装后的shRNA更方便用于动物造模等用途。

⑤留得母鸡（shRNA载体）在，哪怕没蛋（siRNA）吃

siRNA的降解可能导致脱靶，降低敲低效率；而整合到基因组或游离质粒的shRNA持续产生siRNA，维持敲低效率。

2、反义寡核苷酸（anti-sense oligonucleotides，ASO）

反义寡核苷酸（anti-sense oligonucleotides，ASO）是通过碱基配对原则与靶RNA特异性结合，从而调控RNA功能的短单链核酸聚合物，通常为12-30个碱基组成的RNA或DNA。根据ASO设计的靶向位置、靶向对象、化学修饰的不同，能发挥不同作用。

ASO降解RNA机制

①Gapmer phosphorioate (PS) ASOs可通过RNase H1触发RNA的降解。Nase H1是一种内源性核酸酶，促进RNA-DNA异源双链中RNA的断裂。在哺乳动物细胞中，RNase H1存在于细胞核、线粒体和细胞质中，可以清除Okazaki片段中的RNA、DNA修复和R环的分解。

②ASO可被设计成诱导Ago-2介导的RNA降解，称为单链siRNA，类似于双链siRNA的机制。

③ASO可作用于pre-mRNA触发可变剪接，产生含有提前终止密码子(PTC)的mRNA, 导致无义介导的mRNA衰变(NMD)。

④ ASO可作用于成熟mRNA触发No-go衰变。

⑤ ASO作用于成熟mRNA，也可阻断核糖体扫描并阻止翻译，导致蛋白质水平降低。

⑥ASO可结合到mRNA的5’UTR，从而抑制翻译起始因子的结合，或引导帽结构的切割，从而抑制翻译。

⑦ 可以结合参与降解和聚腺苷化的pre-mRNA序列，改变聚腺苷化位点，调节mRNA的稳定性和水平。

图5 ASO在RNA水平下调基因表达的机制[2]

ASO化学修饰

引入不同的化学修饰可提高ASO效力、稳定性和靶标亲和力。未修饰的ASO在体内极易被核酸酶降解，磷硫酸酯(PS)和磷酸二酰胺吗啉低聚物(PMO)的修饰可降低ASO的降解风险，且PS修饰的ASO部分具有亲脂性，能促进ASO进入细胞或组织。糖修饰可增强与靶RNA结合的亲和力，减少非特异性脱靶效应，影响核酸酶的稳定性等。LNA修饰，也可增强结合亲和力、序列特异性、热稳定性和核酸酶抗性。2’-MOE和PS 2’-cEt修饰可以增强核酸酶的稳定性和对靶RNA的亲和力。GalNAc偶联修饰，可靶向唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）并增强PS ASOs向肝细胞的递送。

图6 ASO的化学修饰[2]

ASO vs siRNA

相比siRNA，ASO最大的优势在于可以设计根据不同途径调控基因的表达，设计不同化学修饰调整其靶向性和效用，而且ASO在细胞核核细胞质都可以发挥作用。当需要作用于细胞核内的RNA，若所研究的RNA（如lncRNA）在细胞核内发挥作用，或者希望影响pre-mRNA的功能，此时就可以考虑使用ASO。

固体培养基上典型的支原体菌落，具有“煎蛋”形态[2]

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参考资料

[1] Rao DD, Vorhies JS, Senzer N, Nemunaitis J. siRNA vs. shRNA: similarities and differences. Adv Drug Deliv Rev. 2009, 61(9):746-59.

[2] Crooke ST, Baker BF, Crooke RM, Liang XH. Antisense technology: an overview and prospectus. Nat Rev Drug Discov. 2021, 20(6):427-453.