如何战胜细胞实验的“无形杀手”——支原体？

知己知彼百战百胜！

先了解支原体是个什么东西？

支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁、能独立生存的原核生物，大小约0.1-0.3μm，介于细菌和病毒之间。细胞培养物中最常见支原体的有猪鼻支原体（M. hyorhinis）、口腔支原体（M. orale）、精氨酸支原体（M. Arginini）和莱氏无胆甾原体（A. laidlawii）。此外还有20多种能污染细胞的支原体，有的细胞株甚至能同时污染多种支原体。前段时间流行的肺炎支原体是致病性的，但大多数支原体不致病。

M. Mycoides（一种常见的污染细胞培养物的支原体）模型图[1]

是谁引入了支原体？

① 细胞培养人员的口腔、皮肤等；

② 细胞培养操作环境或实验器材；

③ 培养基，如胎牛血清和新生牛血清可能带有精氨酸支原体和莱氏无胆甾原体，猪来源的胰酶可能存在猪鼻支原体等。

④ 外来细胞株，特别是原代细胞。

支原体杀伤力有多强？

① 影响细胞生长和代谢

支原体消耗营养物质，增加代谢废物，导致pH改变，促进或抑制细胞因子表达，可能导致染色体畸变，影响细胞的形态和生长特性、免疫和代谢机制等。

② 增加细胞碎片

支原体使培养体系中的细胞碎片增加，影响细胞的附着、贴壁、增殖，需频繁换液。

③ 交叉感染

支原体能迅速繁殖，很快又“见缝插针”入侵到其它培养体系中，导致污染不断扩大。

④ 严重影响实验结果

支原体不仅影响细胞的遗传代谢途径，改变细胞原本的生物学特性，还会直接引入DNA、RNA、蛋白及其它代谢物的污染，影响实验的准确性及可重复性，甚至会得到相反的研究结论。

尤其在高通量测序研究中，支原体污染影响极大。支原体基因组小，但编码基因数量较多，直接带来的核酸污染，其基因表达可能与培养的细胞存在一定相似性，出现一些难以解释的基因表达信号，给结果解读带来困难；支原体带来的核酸污染占据相当一部分测序数据量，干扰目标细胞数据的获取，导致目标数据量不足。因此，开始实验前一定先确保细胞没有支原体污染啊！不然就功亏一篑了。

支原体有多难对付？

①（能见缝插针、突破防线！）支原体细胞小，可通过220纳米孔的除菌过滤器滤膜；

②（会易容术啊！）支原体形态多变，难以用显微镜观察或鉴定；

③（常规毒对它无效！）支原体对靶向细胞壁合成的抗生素无反应；

④（无声息地扰乱局势）支原体感染丰度可达10^8个/mL，而不引起明显浑浊，可能对细胞生长无明显影响，甚至可能在短时间内促进细胞增殖（别问我怎么知道的o(╥﹏╥)o）。

⑤（隐忍的潜伏策略）支原体可能维持较低水平污染，灵敏度较低的方法很难检测到。

那么，怎么设防避免支原体污染？

① 检测新样品或试剂，如细胞、培养基、血清等，试剂分装使用。

② 定期检测培养中的细胞，及时发现及时处理。

③ 规范无菌操作；正确消毒灭菌；感冒咳嗽尽量不进入细胞房，如必要，在操作后彻底将使用空间灭菌消毒；

④ 适量使用针对支原体的抗生素，但用量尽量少，避免支原体产生耐药性。

出什么招才能打赢支原体？

第一步：监察敌情

怀疑支原体感染的细胞状态：细胞增殖减缓慢；状态变差；边界模糊；形态异常，但上清液清澈；背景干净且换液后无改善。

准确检测支原体污染：单凭观察难以确定支原体污染，需要用更精准的检测方法。就算没有怀疑对象，也应该定期检测培养的细胞。目前已开发了微生物培养法、DNA荧光染色、ELISA等多种支原体检测方法，其中省时省力省心又精准的方法要数Taqman qPCR法。

固体培养基上典型的支原体菌落，具有“煎蛋”形态[2]

使用试剂盒检测最便捷稳妥！吉赛生物支原体检测试剂盒GSDetect® Taqman Mycoplasma Detection Kit（UNG plus），配套了基于 Taqman qPCR 法检测支原体的相关试剂，包括针对支原体 16S rRNA 的保守区域序列设计的特异性引物和荧光探针（FAM 标记）。使用试剂盒可直接以细胞培养上清或血清等生物材料为模板，进行qPCR即可精准检测常见的 16 种支原体。试剂盒内添加 dUTP/UNG 酶体系，能避免 PCR 产物气溶胶污染导致的假阳性，大幅提高检测的准确性。

第二步：正面交锋

①（划分禁区）及时将支原体污染的细胞隔离处理。

②（初步清除）多次洗涤细胞和低速离心换液，去除上清中较小的支原体，使细胞培养体系中的支原体数量降至最低。

③（对症下药）利用支原体敏感的抗生素进行抑杀。支原体无细胞壁，对内酰胺类、万古霉素等抗生素不敏感，可使用大环内脂、四环素和喹诺酮三类抗生素目前公认对抗支原体效果较好的药物，也可使用其它支原体清除剂，或支原体清除培养基。

知己知彼，而后见招拆招，这样就再也不用担心支原体污染细胞影响实验结果啦~~

吉赛生物Taqman探针法支原体检测试剂盒

(UNG防污染版)

产品特点

① 操作简便，直接使用1μL细胞培养上清或血清进行检测，无需提取DNA。

② 检测灵敏度高，准确率高，耐受青霉素和链霉素或其他抑制物的影响。

③ 特异性强，只能扩增支原体DNA，不会扩增细菌真菌或真核细胞的DNA。

④ 检测快速，最快1小时即可判定结果。

试剂盒可检测的支原体类型

*：培养细胞中污染最常见的支原体类型。

产品规格

参考资料

[1] https://pdb101.rcsb.org/sci-art/goodsell-gallery/mycoplasma-mycoides

[2] Uphoff CC, Drexler HG. Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures. Curr Protoc Mol Biol. 2014. doi: 10.1002/0471142727.mb2804s106.