如果让“钓鱼佬”做RIP……

RIP技术就好比钓鱼，抗体是鱼饵，目的蛋白-RNA复合物就是大鱼，想要钓到大鱼，装备和技术都很重要！

什么是RIP？

RNA Immunoprecipitation（RIP）是研究细胞内RNA与蛋白结合的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。RIP利用特异性抗体对目标蛋白进行捕获，实现目标蛋白-RNA复合物的富集，再通过对复合物中蛋白和RNA的检测和分析，探索分子间相互结合关系。

分离复合物中的RNA，可通过qRT-PCR或高通量分析技术（高通量测序、基因芯片）对其定性及定量分析；分离复合物中的蛋白，通过WB或质谱等方法，可用于做质控、检测目标蛋白抗体质量以及研究与目标蛋白结合的其他互作蛋白。

“钓鱼佬” 怎么做RIP？

真的跟钓鱼很像

老练“钓鱼佬”聊聊RIP实验如何优化？

#1选对合适的鱼饵（抗体）

鲤鱼爱吃玉米，青鱼爱吃螺丝，要钓到想吃的大鱼，需要根据鱼的习性选择鱼饵。

RIP实验是以RNA结合蛋白（RBPs）出发，研究与目的RBPs互作的RNA或蛋白，因此选择的抗体必须具有较强的特异性且结合能力，才能高效准确拉取需研究的RNA-蛋白复合物。

使用IP级抗体

市面上有针对WB、IHC/IF、IP等不同实验的抗体：WB抗体一般选用人工合成多肽作为抗原制备，识别蛋白质的线性抗原表位；IHC/IF抗体识别的是未经加热变性处理的抗原表位，属于构象型或线性，一般用重组蛋白作为抗原制备，也可是人工合成多肽作为抗原制备；IP实验需要识别自然状态下的蛋白，因此最好选择天然蛋白作为抗原制备的抗体，也可选择由重组蛋白抗原制备的抗体。而人工合成多肽作为抗原制备的抗体，可能由于识别位点包裹在蛋白质内部无法识别，因此IP实验最好不要选择这种抗体。

多克隆抗体vs单克隆抗体

多克隆抗体能结合靶蛋白的多个不同表位，为异质性抗体混合物，即同一靶蛋白可能结合多个抗体，因此多克隆抗体具有很高的亲和性。在RIP实验中使用多克隆抗体，能更容易拉取目的蛋白，有利于获得更好的结果。

单克隆抗体只检测每个抗原上的一个表位，不易与其它蛋白质发生交叉反应，因此具有很高的特异性，在定量实验中产生的背景信号更少。单克隆抗体能提高实验重现性，且能高效结合目的抗原。但与多克隆抗体相比，单克隆抗体更容易受化学处理造成的抗原表位丢失的影响。

多克隆抗体和单克隆各有优缺点，可根据自身实验需求及目的蛋白的情况选择合适的类型。

#2选好性价比高的鱼竿（试剂盒）

RIP实验涉及的缓冲液试剂较多，一般使用试剂盒进行RIP实验，国内外有众多RIP试剂盒产品，但试剂盒和鱼竿一样，不需要选择最贵的。

吉赛生物的RIP试剂盒（PureBinding®RNA Immunoprecipitation Kit）获得了众多“钓鱼佬”青睐，还能提供及时且专业的“垂钓咨询”！

#3适当调整钓鱼技巧（实验步骤）

样本准备

实验中需要使用无RNase的吸头及离心管，尽量降低环境中RNase对实验的影响；细胞裂解时，应温和，防止核酸析出聚集成团；如果裂解不充分，可以适当增加裂解时间，但不宜过长，因为会使RNA降解；如果后续需进行高通量测序，则细胞样本必须先排除支原体污染。收集样本后，可先做目的蛋白的预检，即裂解细胞后，取部分细胞裂解液用IP抗体进行WB实验，检测裂解液中蛋白的含量及抗体的质量，从而调整样本的用量及抗体的使用。钓鱼也得选好水域，水库和鱼塘都可以，但污水沟里是钓不到好鱼的。

捕获抗原

RIP实验一般是先把抗体链接到磁珠，再与裂解液中抗体孵育，因此抗原抗体孵育步骤需要在垂直混匀器中进行，避免磁珠沉底结块。孵育时间需适当（2h~过夜），时间太短可能导致抗原抗体结合不充分，时间太长则可能导致背景增加或者RNA降解。具体孵育时间可根据实验样本或者预实验情况而定。

孵育后洗涤

多次洗涤或者更剧烈的洗涤，对改善背景有一定的帮助，但也有可能破坏目标复合物之间的互作。

RNA提取

免疫沉淀得到的RNA，量一般很少，一般采用微量RNA提取方法。

吉赛生物RIP试剂盒（PureBinding®RNA Immunoprecipitation Kit）配备柱式提取RNA相关试剂，更省心更高效更高质。产量RNA量较少，会导致RNA纯度和浓度测量不准确，可通过RT-qPCR或高通量测序检测分析。

#4吃鱼肉还是喝鱼汤？（准确分析结果）

大鱼钓上来了，那不得好好做顿鱼宴和家人们分（xuan）享（yao）啊！同样，得到RIP产物之后，可根据不同需求进行分析，让文章大放光彩。

可取RIP洗脱产物进行WB检测，根据结果分析目的蛋白丰度、富集效率、抗体质量等，可依据WB结果对实验条件或操作进行相应调整。

若需要寻找RBP互作的RNA，想研究RBP结合的RNA有哪些类型，可以进行高通量测序，从而对比Input组分析IP组中RBP互作RNA类型。

若有预测的互作RNA，或验证RIP-seq结果中的某种RNA，则可以通过RT-qPCR检测具体的互作RNA。结果一般用Input组目标基因CT值作为参照，IgG阴性对照组和IP组目的基因的相对表达量分别作柱状图（如下图），IgG阴性对照组和IP组目的基因相对表达量有统计学意义则认为目的RBPs和RNA有结合。

图引用自发表于期刊Molecular Cancer的文章“The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC”，该研究使用吉赛生物RIP试剂盒（PureBinding®RNA Immunoprecipitation Kit），anti-FUBP1或anti-IgG抗体对MCF-7细胞裂解液进行RIP检测，然后用RT-PCR和qRT-PCR检测circACTN4的富集程度。

有人说生物实验是一门玄学，但是RIP实验和钓鱼一样，成功都是有迹可循。准备优质的试剂和样本，保持良好的心态，注意实验步骤细节，取得好的实验结果，发高分文章便指日可待。钓鱼可以找外援，RIP技术服务也可以找吉赛生物，吉赛生物可提供细胞培养——RIP实验——高通量测序/RT-qPCR/质谱分析/WB——结果分析一条龙服务！可随时联系小吉探讨技术，小吉摸着鱼在线等……