RNA过表达

服务介绍

RNA作为生物体内的遗传信息载体，根据结构和功能的不同分为信使RNA（Messenger RNA，mRNA）和非编码（Non-coding RNA，ncRNA），在基因调控层面，这些RNA分子起到了至关重要的作用。

吉赛生物研发的第五代RNA过表达载体可对mRNA/lncRNA/circRNA分子实现精准表达，能满足普通真核表达、慢病毒包装和腺相关病毒（AAV）包装等多种用途。其中circRNA载体均携带优化过的侧翼成环框架，含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的结合位点，并使用全新设计的环化介导序列，使插入的circRNA准确高效环化，mRNA及lncRNA表达载体携带强启动子及KOZAK序列，使mRNA/lncRNA精准正确表达。

技术优势

1. 过表达效率高；

2. 特异性强、准确率高：优化筛选过的表达元件有效保证目标RNA分子的序列准确表达；

3. 稳定性高：mRNA、lncRNA（100-3000nt序列）；circRNA（200-2500nt序列）均能实现准确高效过表达；

4. 适用范围广：可用于细胞转染、包装慢病毒或腺相关病毒，同时可提供GFP绿色荧光蛋白标记和嘌呤霉素抗性基因标记，适用于客户不同的实验需求。

服务流程

1. 载体构建；

2. 瞬时转染；

3. 特异性引物设计合成；

4. RT-qPCR验证；

5. Sanger测序验证；

6. 病毒包装（可选，列于病毒包装项目）

客户提供

1. 基因ID/物种/全长序列

2. 载体名称

我们提供

1. 目的载体：10μg质粒+200μL甘油菌/对照载体：10μg质粒+200μL甘油菌；

2. 载体构建与验证实验报告：

①　载体构建步骤；

②　载体测序验证结果原始文件；

③　细胞转染实验步骤；

④　qPCR实验流程方案及产物测序；

⑤　载体构建与验证实验报告。

qRT-PCR检测

图1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达差异

qPCR产物测序结果：

注：hsa_circ_00AAAAA在circBase中的环化位点序列GATTATGGAAACAGCTTTTTATAACTATGATG

结论：

相比于对照组，CAAAAA组的过表达倍数为***；PCR产物测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。

1. circRNA过表达怎么做？

CircRNA的形成和线性RNA不同，因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体（如pcDNA3.1）来进行。已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列（RCMs，如Alu元件）或与能调控circRNA生成的蛋白（如QKI）的结合位点，因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列，质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链，再依靠长下游的反向互补配对促使成环。

2. circRNA过表达成功标准？

载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。

1）qPCR检测有过表达倍数，质粒瞬转效率高，基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上；

2）使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带，PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。