DRUG-seq

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DRUG-seq，全称Digital RNA with pertUrbation of Genes (DRUG)-seq，即高通量药物筛选RNA测序。该技术是针对在96/384孔板上的微量细胞，通过孔标签及UMI定量技术进行全长扩增的转录组测序技术，是CMC申报流程中前期药物筛选的重要环节。在进行数百种候选药物和实验条件的高通量筛选时，实现全部样本的转录组同时检测，获取丰富的药物作用信息。Drug-seq可以利用精准分析表达谱，从而定位药物影响细胞的特异代谢途径，同步揭示用药后细胞转录水平的变化，全面、深入地评估候选药物，提升药物发现的效率和成功率。

DRUG-seq技术路线图

DRUG-seq应用

1. 确定化合物作用机理：验证已知靶点化合物作用机理，或推测未知靶点化合物的可能的作用机理；
2. 研究不同化合物对间接靶点的剂量动力学差异；
3. 评估不同化合物引起的生物功能差异；
4. 评价化合物作用于非靶基因引起的生物功能等。

测序方案

测序模式：Illumina Novaseq
测序数据量：1-2G/well

Drug-seq技术优势

1.通量高：可一次性获得96或384孔板所有孔细胞内转录组水平的基因表达情况；

2.周期短：同时进行96孔或384孔样本的实验，实验周期短至20个工作日；

3.成本低：96孔或384孔样本合并建库测序，成本远低于传统RNA-seq；

4.起始量少：细胞起始量在2,000~20,000均可实验；

5.分辨率更高:相比传统药物高通量筛选技术针对于细胞表型，基于RNA测序的Drug-seq药物筛选技术可以针对基因层面；

6.生信分析全面：可做标准化分析，也可根据要求定制分析；基于基因差异表达的分析，既可定位至药物影响下细胞的特异代谢途径，又可以同步揭示药物的其他作用效应，获取多维的药物作用信息，全面评估药物的作用机制。
研究对8个剂量的433种化合物进行概念验证实验中，由DRUG-seq技术获得的转录谱成功地根据其预期靶点的作用机制(MoAs)将化合物进行功能分类。在涉及相同靶标的化合物中检测到反映在转录组变化中的扰动差异，证明了使用DRUG-seq了解靶标上和脱靶活性的价值。[1]

图1. DRUG-seq的性能与标准RNA-seq相当

图2. 化合物与调控机制的tSNE聚类分析

图3. 不同浓度化合物处理后，具体基因的表达变化

图4. 化合物处理后，差异基因表达分析

参考文献
[1] Ye C, Ho DJ, Neri M, et al. DRUG-seq for miniaturized high-throughput transcriptome profiling in drug discovery. Nat Commun. 2018, 9(1):4307. doi: 10.1038/s41467-018-06500-x.
生物信息分析

基础分析
1. 原始数据质控检查
2. 比对结果质控检查
3. 基因表达定量分析
4. 样品主成分分析
5. 样品与基因聚类分析
6. 差异基因表达分析
7. 差异基因GO功能分析
8. 差异基因KEGG通路分析
9. 差异基因Rectome通路分析
10. 差异基因GSEA富集分析

个性化分析
1. 相关基因互作分析(药物处理后，与疾病相关的所有基因及其相互作用关系)
2. 基因共表达分析(药物处理后，与疾病相关的所有基因及其相互作用关系)
3. 趋势分析（不同药物浓度处理的基因表达变化，药物处理后不同时间段的变化——时序分析）
（其他定制化分析请详询）

Table. Drug-seq样本送样建议

送样类型	送样量	操作参考	寄送方法
贴壁细胞	2000-10000 cells	50-100μL PBS 洗涤细胞两遍，彻底去除PBS后，加30uL Lysis Mix，室温吹打裂解 6 min	液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送，裂解物不要冻融，处理后当天寄出
悬浮细胞	2000-10000 cells	细胞培养悬液吹打混匀，每孔取出10uL，按照1:1加入Lysis Mix(10μL)，混匀室温裂解 6 min	液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送，裂解物不要冻融，处理后当天寄出

*更具体的送样方法请详询销售或技术支持

1.该产品可同时完成96例样本的混合建库，如何获得对应样本的序列信息？
答：通过特定的样本标签well barcode以及UMI定量技术，在96孔板中进行不同样本的mRNA标记，标记完成的cDNA可以混合在一起，构建1个混样的NGS文库。NGS测序后通过barcode序列识别空标签，并将well barcode和UMI信息拆分还原到96孔板的不同样本。在取用样本标签时，应注意标记每孔所对应的UMI各孔编号，否则导致该孔对应转录组文库信息无法正确拆分。

2.每孔样本标签UMI可以反复使用吗？
答：每孔对应的样本标签well barcode和UMI只能使用一次，避免反复使用出现交叉污染。使用样本标签时，冰上融化后震荡混匀离心后用枪头扎破使用，切勿撕掉膜使用。

3.试剂盒适用于什么其实材料？
答：新鲜细胞和冻存细胞（推荐细胞投入量：5k~30k/well），Total RNA（推荐投入量20ng~100ng/well）

4.细胞裂解和RNA捕获时，裂解的时间对获得cDNA的影响？
答：为了获得质控较好的cDNA，按照实验要求时间操作，裂解时间过长时，RNA容易降解，后续cDNA中小片段占比高。

5.混合建库测序时，是否有推荐的测序量？
答：推荐测序数据量：1G/well