蛋白组和转录组之间，你还差一个翻译组：Polysome profiling/Ribo/RNC/Disome-seq技术详解

根据中心法则，DNA是遗传信息的载体，蛋白质是生物活动的主要执行者。蛋白表达丰度受RNA合成（转录）、RNA降解（转录后）、蛋白质合成（翻译）和降解（翻译后）等多个过程的影响。

RNA翻译蛋白过程连接转录组和蛋白质组，极消耗能量，因而受严密的调控，以节省细胞资源，并避免毒性蛋白质的产生。

翻译速率可决定蛋白质的折叠构象、定位与功能、产量及对应的细胞表型。蛋白质合成(翻译)速率与最终蛋白质丰度的相关性较高，翻译速率对蛋白质水平的贡献最大。因此，翻译组研究是分析基因表达和调控水平的重要环节。

更重要的是，近年来陆续有研究发现，曾被认为非编码的RNA（ncRNA）可编码或翻译蛋白，而翻译组分析可精准可视化研究编码全新隐秘多肽的ncRNA（如circRNA、lncRNA）。

——传统的“黄金标准”

Polysome profiling技术是基于蔗糖浓度梯度溶液超离心，将细胞质RNA分离成多个组分：游离RNA，结合核糖体40S或60 S亚基、单核糖体(80S)或多聚核糖体等。一条翻译的mRNA可同时结合多个核糖体，结合核糖体组分的RNA与总胞质RNA的比例可以间接反映翻译水平。

①裂解细胞：添加翻译延伸抑制剂，在增殖阶段裂解细胞，分离细胞质裂解液；

②超速离心：把裂解液转移到梯度蔗糖溶液后，超速离心将RNA分离成不同的组分；

③收集组分：利用密度梯度分馏系统，UV吸光度检测核酸浓度并收集各个组分；

④回收产物：从蔗糖溶液组分中回收RNA复合物；

⑤分析产物：绘制核糖体图谱；RT-qPCR分析特定RNA；高通量测序分析全局RNA概况；Western Blot或质谱分析蛋白质。

① 直观反映细胞和组织内的翻译状态；

② 对胞质RNA翻译水平分级，可针对感兴趣组分进一步分析不同的翻译机制；

③ 结合高通量测序可全面、精准、高通量反映翻译组概况。

① 需专门设备在常规实验室可能无法获得；

② 操作较繁琐：需一系列繁琐的溶液配置、离心、分离、检测等操作步骤，耗时长且对操作者要求较高；

③ 容易受干扰：细胞内普遍存在高分子量的复合物，容易对多聚核糖体收集和检测造成干扰。

——更详细地分析翻译的强大工具

Ribo-seq可获得核糖体沿着翻译mRNA的精确位置，从而得到详细翻译事件的直接证据，可在密码子分辨率上进行全翻译组检测。

① 使用延长抑制剂阻止核糖体移位，然后收取细胞;

② 用RNase消化细胞裂解物，裸露的RNA片段打断，而核糖体保护RNA片段得以保留；

③ 去除干扰的rRNA，去除核糖体，收集核糖体保护片段(RPF)，也称为核糖体足迹;

④ 建库，针对RPF深度测序并分析获取的核糖体足迹数据。

① 提供精确而丰富的核糖体位置信息，可更详细分析翻译调控事件，包括翻译起始、延伸、停止和终止或非常规的翻译事件，如非AUG介导的翻译起始、停止密码子读取、以及翻译新的小开放阅读框(sORF)，或以前被认为是非编码RNA (ncRNAs)的非典型可翻译RNA；

② 可瞬时捕获翻译过程的状态，定量分析翻译效率，对研究翻译调控动态变化具有重要意义；

③ Ribo-seq可同时捕获大量基因的翻译活动，为构建全局性翻译提供可能，结合RNA-seq，可系统研究基因表达与翻译调控之间的关系。

① 细胞中不同的mRNA的核糖体延伸率不同，无法区分翻译活跃的核糖体和停滞状态的核糖体，可能导致翻译效率的偏差；

② 小RNA片段(如调控性非编码RNA)的污染可能导致翻译组数据的误解；

③ 核糖体的构象、不适当的核酸酶酶切和特定的RNA二级结构，都可能影响足迹长度。

——全长翻译mRNA测序

RNC-seq技术分离出核糖体结合RNA进行高通量测序，不经过RNase处理，保留RNA全长信息。

① 实验操作较简便；

② 较长的片段建库，排除了潜在的污染物(如调控性小RNA)；

③ 长片段更可能跨越mRNA和circRNA的剪接位点，检测更多的选择性剪接(AS)异构体或翻译circRNA；

④ 与RNA-seq结合使用，可通过计算翻译比率，评估哪些mRNA剪接变体在全基因组范围内翻译。

①RNC RNA易降解；

②一个或多个核糖体结合的翻译RNA分子被统一分析，而不是像polysome Profiling分成多个组分进行分析，翻译效率分析准确性较低；

③若无合适计算分析，RNC-seq由于丢失了翻译RNA上核糖体的位置信息，而无法精确定义非常规ORF的位置，只能为非规范ORF的翻译提供间接证据。

——翻译调控研究新技术

停滞的核糖体(stalled ribosomes)是指在翻译过程中暂时停止或显著放慢移动的核糖体。核糖体停滞可能由于多种原因，包括罕见密码子的存在、mRNA的超二级结构、损坏的mRNA或特定的结合蛋白质的存在，直接导致异常蛋白的合成或核糖体的缺乏，从而调控翻译。核糖体碰撞形成的串联双核糖体，可介导共翻译事件，对细胞稳态具有重要作用。

Disome-seq是基于Ribo-seq发展的技术，通过分离核糖体-RNA复合物，用RNase进行酶切消化，裸露的RNA被酶切，而核糖体保护的RNA得以保留。然后分离纯化得到双核糖体保护的RNA片段，进行建库测序。

Disome-seq具有Ribo-seq技术的优势的同时，可针对双核糖体碰撞发生的RNA进行分析，有利于研究共翻译等特殊翻译调控机制。

①揭示全局RNA中碰撞双核糖体的足迹；

②针对性研究翻译停滞、共翻译等特殊的翻译调控事件。

① 仅针对性分析串联双核糖体结合的RNA；

② 对样品处理和分析的要求较高，可通过增加核糖体图谱分析环节，通过检测双核糖体的特征峰，筛选合格样本进入下游分析流程，有效保障建库测序数据质量。

Polysome profiling可以准确研究翻译效率，研究翻译调控、翻译活性等；

Ribo-seq可以研究RNA的翻译机制、翻译起始和终止位点及ORF等；

RNC-seq可以研究翻译复合物的组成和活性，以及挖掘潜在可翻译的非典型RNA；

Disome-seq可以分析双核糖体或核糖体碰撞事件研究特定的翻译调控机制。

其中，Ribo-seq和RNC-seq实际上是从两个不同的方面评估RNA翻译，两者不能相互替代。