表观调控如何实现“向上管理”和“向下负责”？

“epigenetics”（表观遗传学）是描述不改变DNA序列的可遗传表型变化。也就是，特定刺激不引起DNA序列突变，而是通过表观遗传调控，上至影响基因转录，下至改变蛋白活性，从而对表型产生可遗传的变化。

表观调控在病理和生理变化中起重要作用，是当今生命科学研究的前沿和热点。那么，下面就来扒一下表观遗传调控有哪些方式，又该怎么研究。

一、转录调控

①转录因子/转录抑制因子

转录因子或转录抑制因子可能由于蛋白修饰、表达水平变化、其它共调节因子或作用位点变化等影响与靶DNA的相互作用，调控转录。

②DNA修饰

真核细胞中最常见的是5mC甲基化修饰，可作为反式调节因子发挥作用，也可改变染色质的结构与活性。DNA甲基化可通过干扰转录调控因子的识别位点，或通过甲基化CpG岛的结合蛋白招募转录调控因子，调控基因表达。

③组蛋白修饰

组蛋白的翻译后修饰主要有：小分子化学基团修饰，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、生物素化等；肽类修饰，包括泛素化、SUMO等。组蛋白修饰可通过改变染色质的结构，改变与DNA的结合状态，影响其他调控因子的互作，从而调控DNA复制、转录和染色质浓缩等。

④染色质重塑

特定的蛋白质复合物可利用ATP水解释放的能量，使组蛋白核心八聚体暂时脱离DNA，或使核小体核心沿DNA滑动，促进高度有序的染色质结构变化，从而促进其他蛋白质的结合和异染色质的形成，或影响转录因子的结合。

⑤非编码RNA调控

位于细胞核的非编码RNA如lncRNA、circRNA，可作为蛋白支架，影响转录复合物的形成和活性；也可作为蛋白海绵，与转录复合物竞争性结合转录因子或转录调控因子，从而调节转录。

相关阅读：circRNA如何调控转录

转录调控研究技术

（1）染色质免疫共沉淀（ChIP）：超声或酶处理随机切割染色质后，利用抗原抗体特异性识别反应，沉淀目的蛋白结合的DNA片段，反交联并纯化DNA后，进行高通量测序或qPCR分析。

应用

●组蛋白修饰：利用特定修饰组蛋白的抗体进行ChIP，可揭示组蛋白修饰对应的基因组位置；

●转录因子调控：利用转录因子或调控蛋白抗体进行ChIP，可精准地探索其调控的靶基因及位点；

图1 ChIP技术路线

（2）染色体可及性测序（ATAC-seq）：通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，提取DNA后，进行高通量测序。

应用

●转录活跃基因：获得特定条件下所有活跃转录的基因序列；

●转录因子：通过聚类分析，挖掘开放位点的潜在结合转录因子；

●转录水平：结合RNA-seq获得的全转录组信息，得到基因表达水平数据。

图2 ATAC-seq技术路线

二、转录后调控

①调控性非编码RNA

miRNA可引导AGO2蛋白为核心的沉默复合体，对靶RNA进行切割；而lncRNA和circRNA可以通过ceRNA机制竞争性吸附miRNA，逆转miRNA对靶RNA的负调控。

②RNA修饰

主要的RNA修饰主要有m6A、m5C、m7G甲基化、假尿嘧啶修饰等，涉及转移酶（Writer）、去修饰酶（Eraser）、以及阅读蛋白（Reader）等相关蛋白的作用，可调控RNA的稳定性、翻译效率甚至介导翻译起始、核输出、剪接和降解等。

③RNA结合蛋白

RNA结合蛋白（RBP）包括RNA修饰相关蛋白、翻译复合体、剪接复合体、沉默复合体、核输出蛋白等，参与调控RNA的稳定性、翻译、核输出、剪接和降解等众多途径。

转录后调控研究技术

（1）RNA免疫沉淀（RIP）：利用针对目标蛋白质的抗体，沉淀相应的RNA-蛋白质复合物，分离纯化复合物上的RNA，进行高通量测序或qRT-PCR分析。

应用

●RBP：利用RBP的抗体进行RIP，分析特定RBP互作的RNA；

●miRNA调控：利用anti-Ago 2抗体进行RIP，研究可能受miRNA调节的RNA；

●RNA修饰：利用RNA修饰相关蛋白（如甲基化识别蛋白）的抗体进行RIP，研究可能含有特定修饰调控的RNA。

图3 RIP技术路线

（2）RNA pull-down（标签法）：将RNA标签（可产生特殊结构结合捕获蛋白）引入目标RNA中，利用捕获蛋白结合目标RNA上的标签，产生捕获蛋白/目标RNA/RBP/调控性RNA复合物产生，再通过捕获蛋白抗体下拉复合物，提取复合物中的蛋白质进行质谱或Western Blot检测，或提取复合物中的RNA进行高通量测序或qRT-PCR检测。

应用

●RBP：产物进行质谱或WB，可揭示与目标RNA互作的相关调控蛋白质；

●调控性ncRNA：产物进行高通量测序或qRT-PCR，可分析与目标RNA互作的调控性RNA。

图4 RNA pull-down（标签法）技术路线

（3）RNA pull-down（探针法）：利用生物素标记的RNA探针与目标蛋白进行体外结合，然后将结合的复合物分离纯化，然后进行质谱或Western Blot分析。

应用

●RBP：揭示与目标RNA互作的相关调控蛋白质。

图5 RNA pull-down（探针法）技术路线

（4）RNA甲基化免疫共沉淀（MeRIP）：利用m6A抗体识别并结合具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，对富集下来的RNA片段进行高通量测序或qRT-PCR分析。

应用

●m6A修饰：MeRIP-seq结合生物信息学分析，即可在全转录组范围内对m6A修饰进行系统研究,全面揭示和挖掘甲基化修饰的RNA。

图6 MeRIP技术路线

（5）Nanopore Direct RNA测序：对天然RNA进行单分子水平的全长测序，不需PCR扩增，可保留并检测RNA碱基修饰信息。Nanopore测序是通过检测特定的电流变化，识别碱基。RNA碱基修饰的电信号不同于对应的标准碱基，因此可通过分析电信号，可识别碱基修饰。

应用

●RNA修饰和转录水平：可全面直接识别RNA碱基修饰信号，同时得到目标基因的转录水平和表观修饰信息。

图7 Nanopore Direct RNA测序技术路线[1]

三、翻译后调控

①蛋白质修饰

蛋白表达和修饰是蛋白功能的最重要影响因素。蛋白修饰如磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化、糖基化等，蛋白修饰可以直接影响蛋白的功能、活性或与其它蛋白的互作，从而影响表型。

②蛋白互作

蛋白质与蛋白质之间的相互作用也可以影响蛋白的丰度、修饰、活性或通过改变蛋白质构象影响其功能。

③非编码RNA

非编码RNA也可以作为蛋白支架介导蛋白质相互作用从而影响蛋白质功能，或作为蛋白海绵影响蛋白质的定位和功能。

翻译后调控研究技术

（1）免疫共沉淀（Co-IP）：利用特异性抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白，提取纯化蛋白后进行质谱或Western blot分析。

应用

●蛋白互作：下拉蛋白复合物，研究互作的蛋白；

●蛋白修饰：利用特定修饰的特异性抗体进行Co-IP，然后定性或定量检测特定修饰的蛋白质（多肽）；

●未知蛋白：利用标签抗体富集偶联标签的未知蛋白（多肽），并进行研究。

图8 Co-IP技术路线

（2）修饰蛋白组研究：对特定修饰的蛋白进行富集后，利用质谱技术进行全面分析。

应用

●蛋白修饰：利用质谱技术能准确定性定量分析特定修饰蛋白质，并揭示具体修饰位点。

图9 基于质谱技术的修饰蛋白组研究技术路线[2]

怎么进行更全面的表观调控研究？

从基因转录、RNA翻译到蛋白发挥功能的生命活动全过程都可能存在表观调控机制。因此，以上表观调控方式并不是独立存在的，而是可能同时存在，相互影响。因此，研究表观调控需自上而下或由下到上，进行更系统的分析。

吉赛生物具有完备的三代/二代测序、质谱分析、分子生物学、试剂生产等平台，拥有专业的生信分析团队和技术支持团队，可提供以上技术的服务和产品，更全面的多组学联合分析，更专业和精准的表观调控整体研究解决方案！

转录调控

转录后调控

翻译后调控

相关技术服务

ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq、RIP、MeRIP-seq、Nanopore Direct RNA测序、RNA pull-down（探针法/标签法）、RNC-seq、Ribo-seq、Polysome profiling（seq）、Disome-seq、Co-IP、（修饰）蛋白组研究

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参考资料

[1]Workman R E,Tang A D,Tang P S,et al.Nanopore native RNA sequencing of a human poly(A)transcriptome[J].Nature methods,2019:1-9.

[2]Olsen JV,Mann M.Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry.Mol Cell Proteomics.2013,12(12):3444-52.