H/ACA box小核仁RNA（snoRNAs）可与假尿嘧啶合成酶（DKC1）形成复合物，作为引导RNA（gRNA）。这些H/ACA box小核仁RNA都有反义引导序列形成特征性“泡”的二级结构。这些假尿嘧啶修饰“泡”可设计成与任何靶RNA互补，依赖gRNA的DKC1成为ΨRNA修饰编辑细胞器的理想候选者。

近日，德国美因茨分子生物研究所Edward A.Lemke研究团队在Nature Communications期刊上发表研究论文：Selective RNA pseudouridinylation in situ by circular gRNAs in designer organelles。研究使用RNA引导的DKC1构建了一个RNA修饰细胞器，实现mRNA选择性Ψ修饰。此外，研究利用环状gRNA显著增强了mRNA假尿嘧啶修饰，并通过Ψ修饰靶向抑制终止密码子，为从合成生物学到RNA治疗提供了新的可能性。

结果

设计细胞器增强终止密码子抑制

研究利用源自非洲爪蟾（Xenopus laevis）H/ACA box RNA pugU2-34/44的gRNA，通过设计gRNA，靶向iRFP-eGFP39TAG报告基因，该报告基因只有在提前的终止密码子上发生Ψ修饰才会产生eGFP。

研究在正交翻译膜样细胞器的设计基础上设计细胞器，用啮齿动物LCK酪氨酸激酶（LCK）的n端结构域作为质膜（PM）锚点（图1），蛋白质FUS衍生的内在无序区域（IDR）和主要衣壳蛋白（MCP）作为募集结构域。利用dyskerin在N或C端缺少NLS/NoLS信号的截断形式（aa 22-424，DKC1），并在N端增加了一个核输出信号（NES）。

图1 选择性RNA修饰的膜样细胞器。

研究利用含有ms2噬菌体3'UTR中的两个RNA茎环的iRFP-eGFP39TAG报告基因（效率报告基因）（图2b），RNA茎环可与细胞器结构中的MCP特异性结合，选择性招募效率报告基因。效率报告基因通过ms2/MCP标记系统被显著招募；当与gRNA共转染时，可介导终止密码子抑制；而缺乏IDR或MCP的LCK-DKC1构建体的效率较低（图2b，c）。

进一步研究发现，与表达NAS-DKC1的细胞相比，承载设计细胞器的细胞选择性增加了2.5倍以上（图2d，e），这种效果依赖于ms2茎环。

图2膜样细胞器通过选择性假尿嘧啶修饰介导停止密码子抑制。

环状gRNA显著增强终止密码子抑制

为了优化细胞器对假尿嘧啶依赖的终止密码子抑制的效率，作者受到环化适配体策略的启发，利用twister核酶自剪切，体内形成环状gRNA。

在设计细胞器中，环状gRNA显著增加了GFP阳性细胞的数量（增加了10%）（图3b，c）。这种效果可能由于环状gRNA对外切酶有更大的抗性，积累的水平显著高于线性对应物；也可能由于环状RNA优先从细胞核中输出，而DKC1结构位于细胞质中，这使得环状gRNA的修饰效率更高。

研究进一步设计环状gRNA，在gRNA中添加不同ms2茎环5’和3’，使其可被招募到REO中；并设计了LCK-FUS2-267-4xλN22-FUS2-267-MCP-DKC1细胞器，其中包含四个重复的λN22肽。结果发现，当使用环状gRNA优化的RNA编辑细胞器（OREO）时，选择性修饰进一步提高到4倍。

研究还测试了另外三种曾被应用的膜锚来形成OREO。结果发现，这些OREO靶向高尔基、ER和线粒体的表现与（PM锚定细胞器）LCK相似。

图3环状gRNA可增强假尿嘧啶介导的终止密码子抑制。

环状gRNA选择性假尿嘧啶修饰

研究发现携带细胞器的细胞可保持高选择性（图4a），优先产生mCherry，而环状gRNA的增强作用更为明显，与使用线性gRNA的REO相比，平均增加了一倍以上（图4b，c）。

进一步使用牛津纳米孔技术公司（ONT）的直接RNA测序(Direct RNA测序；DRS)，检测RNA的假尿嘧啶修饰。DRS可进行天然RNA测序，而无需进行事先扩增步骤。在测序过程中，通过检测特定的电流变化，识别碱基。DNA或RNA碱基修饰的电信号模式不同于其对应的标准碱基，因此可通过分析电信号，可识别碱基修饰。

ONT测序小知识

文中利用牛津纳米孔技术（ONT）的直接RNA测序检测假尿嘧啶修饰。ONT测序是新一代基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术，DNA/RNA分子的不同碱基通过Nanopore，产生不同的电信号变化特征，对这些特征信号进行检测和比对，即可获取相应的碱基类型。吉赛可提供circRNA全长、Direct RNA、cDNA-PCR、16S rDNA等一系列的ONT三代测序服务，助力碱基修饰检测及复杂序列全长分析！

Nanopore三代测序优势

①超长读长：读长超二代测序，能鉴定更多遗传变异，应用更广；

②高准确性：不需PCR扩增测序，避免了扩增过程造成的偏差和错配；

③直接测序：保留原始碱基修饰信息，能直接读出碱基的修饰；

④实时测序：快速测序和分析，可体现实时响应的结果；

⑤高灵活性：可适用多种类型样品，可使用独立芯片处理样品，无需批量样品上机。

最常见的假尿嘧啶修饰模式是系统性尿嘧啶-胞嘧啶错配，即假尿嘧啶被检测为C。根据碱基错误信息可将单个reads分类为未修饰和修饰的，从而可量化特定位点的伪尿嘧啶修饰。模拟目标序列，研究合成完全修饰的RNA寡核酸，进行DRS测序，验证了DRS的适用性。

然后，提取了选择性实验细胞的poly-A RNA（图4c），利用ONT直接RNA测序，读取碱基调用错误模式，包括U-C错配。DRS结果与流式细胞术数据一致，OREO靶向的位置被优先假尿嘧啶修饰，修饰水平从2.9倍增加到25.1倍（图4d）。

图4环状gRNA增加设计细胞器介导的假尿嘧啶修饰。

OREO修饰疾病相关mRNA

AldoB基因功能丧失突变，可导致遗传性果糖不耐受。研究设计了针对AldoB148TGA的环状gRNA。Western blot分析显示，高效的靶向修饰可诱导全长AldoB基因表达，同时大幅降低脱靶水平（图4e，f）。

总结

研究根据相分离概念设计细胞器，以高度选择性和依赖引导RNA的方式进行mRNA假尿嘧啶修饰。此外，研究使用环状引导RNA显著增强靶向假尿嘧啶化的有效性。研究通过优化RNA编辑细胞器（OREO）引入空间工程，为靶向RNA修饰的补充了新工具，为提高RNA修饰特异性提供了新的途径。

原文链接

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11502668/