2024年10月26日，转录本（上海）生物科技有限公司（RiboX Therapeutics）用于治疗放射性口干症的RXRG001环状RNA疗法的IND申请，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准进入临床开发阶段。[1]紧接着，2024年10月30日，上海环码生物医药有限公司（CirCode）自主研发用于治疗缺血性心脏病的环状RNA药物HM2002注射液的IND申请被国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）正式受理。

circRNA作为“黑马”明星分子，闯入人们视野；

从在植物类病毒中被发现，到在人体内被大量挖掘；

从被认为是剪接错误的副产物，到被揭示为生物功能的重要调控者；

从被定义为“非编码RNA”，到被发现可翻译；

从作为内源性RNA被研究，到作为工程化RNA被开发应用；

……

随着研究深入和应用开发，circRNA逐渐发光发亮，工程化平台更是为circRNA创造了一个更大的舞台。

工程化circRNA如何诞生的？

体外合成：体外转录得到线性RNA前体，利用化学法，或基于T4 DNA、T4 RNA连接酶、核酶（I型内含子、II型内含子自剪接核酶或顺式连接酶核酶）连接法等技术进行环化，然后纯化得到circRNA；

体内合成：将DNA质粒递送到细胞内，表达前体RNA，然后通过反向剪接和自催化切割等方法生成。

是什么让工程化circRNA如此优秀？

①稳定性高：circRNA因其环状结构，对核酸外切酶具有更强的抗性，与线性RNA相比稳定性更高，半衰期更长；

②安全性高：工程化circRNA模拟体内天然结构，无需额外的修饰，也不存在病原体识别受体（如RIG-I、TLR3、TLR7、TLR8等）的识别序列，不易引起先天免疫反应。纯化后的circRNA分子在体内免疫原性较低，副作用较低，体现其作为药物的安全性；

③原料简单：不需加帽、加尾等结构，不需要引入RNA修饰，利用有效的合成平台可大规模生产，降本增效。

④可翻译性：经过设计的circRNA，加入高效的起IRES等介导翻译起始元件、插入合适的ORF，可在体内稳定、有效翻译所需的蛋白质。

工程化circRNA在什么领域发光发热？

01 机制研究

体外合成内源表达的目标circRNA，转染到细胞中，或利用LNP、外泌体等系统递送到动物体内，可实现目的circRNA的精准、快速、可控的表达/过表达。

膀胱癌细胞来源的细胞外囊泡（EV）中存在circRNA-LIPAR，可诱导SELE过表达的淋巴重塑转移前生态位。研究利用工程化EV装载体外合成的circRNA-LIPAR，然后注射到小鼠体内，进一步验证了EV中circRNA-LIPAR的功能和机制。[2]

图1利用工程化EV装载体外合成的circRNA-LIPAR，通过脚垫注射建立工程化EV教育实验模型。[2]

02 基因或RNA编辑

基因或RNA编辑是遗传性疾病的重要治疗策略。工程化circRNA应用于基因或RNA编辑，可克服线性引导RNA和编辑器的低效率和短寿命问题，还能实现体内原位编辑。

RNA修饰

ADAR蛋白可介导腺嘌呤到次黄嘌呤(A-to-I)的RNA编辑，实现转录后修饰。设计环状向导RNA（arRNA）可招募内源性ADAR，可在体外和体内实现稳健、持久和高度特异性的A-to-I RNA编辑，平均编辑效率可比线性arRNA高约3.1倍，且效力更持久（持续长达21天）。[3]

基于环状RNA引导的假尿嘧啶合成酶dyskerin（DKC1）构建人工膜样细胞器，可显著增强靶向RNA假尿嘧啶化修饰的有效性。[4]

图1环状gRNA可增强假尿嘧啶修饰介导的终止密码子抑制。[4]

基因编辑

CRISPR引导编辑器能实现碱基的精准替换，及小片段的精准插入、替换和删除。利用circRNA表达CRISPR-Cas9蛋白进行基因编辑，具有相当的特异性。[5]

此外，基于ZF蛋白的基因组工程完全依靠蛋白质，尤其适合利用circRNA的表达模式。利用circRNA表达锌指核酸酶(ZFN)的可以进行有效的基因组编辑。[5]

Cas12a编辑系统与Cas9具有相似的功能，在基因治疗和农业生产也具有广泛的应用潜力。通过在circRNA中串联置入靶向多个位点的多个crRNA，以及靶向多个位点的RTT-PBS序列，可引导基于Cas12a开发的引导编辑器（CPE）系统在人类细胞系中同时编辑多达四个基因。[6]

图2基于Cas12a和环状RNA的CPE系统。[6]

基因组修饰

基于基因编辑系统的基因组表观修饰技术，不引入基因组疤痕（无插入、替换和删除序列），可更安全地调节基因表达。例如，对特定基因位点进行甲基化修饰，可使靶内源基因表观遗传沉默；进行去甲基化，则激活基因转录。

表达DNA甲基转移酶DNMT3A-3L和ZF-KRAB融合蛋白的circRNA，可在12天内有效抑制与心血管疾病风险有关的PCSK9的表达。类似地，利用circRNA表达CRISPRoff系统的核酸酶失活Cas9（dCas9）、KRAB、DNMT3A-3L融合蛋白，也可在sgRNA的引导下特异性抑制B2M基因。[5]

图3将表达CRISPRoff WT或变体V4的环状icRNA和ocRNA，以及靶向B2M基因的sgRNA递送到HEK293T细胞。[5]

03 肿瘤免疫

肝外靶向的GSer-CARTs递送表达肿瘤抗原卵清蛋白(OVA)的circ-OVA，能在小鼠模型体内诱导强烈的T细胞反应，且能强效、安全、稳定抑制肿瘤生长，甚至清除肿瘤。[7]

图4 GSer-CART/circOVA复合物可引起较强的抗肿瘤反应，抑制肿瘤生长。[7]

LNP递送表达三个重复的肿瘤新抗原PTPN2多肽片段的circRNA，在小鼠体内能稳定、持久（持续11天以上，线性mRNA只能持续9天）表达抗原蛋白，有效刺激强大的抗肿瘤免疫反应，显著抑制肿瘤生长，整体效果优于线性mRNA，且无明显副作用。[8]

在Lewis肺癌模型中，针对特定肿瘤定制的LNP递送编码白细胞介素-12（IL-12）的circRNA，诱导了强大的免疫反应，导致明显的肿瘤消退。[9]

利用circRNA编码溶瘤内源分子GSDMDENG的蛋白，可激活线粒体裂解特性并诱导小鼠抗肿瘤免疫，显著抑制胰腺、肺和结肠腺癌的发生。[10]

04 CAR-T/TCR-T

基于circRNA的CAR-T疗法可避免传统技术的病毒载体、基因组整合和永久转基因表达所带来的风险，且相比线性mRNA更稳定、表达半衰期更长和免疫原性更低。

相比线性mRNA，表达anti-CD19 CAR的circRNA在小鼠体内，蛋白表达水平和活性明显更高且更稳定，细胞毒性更强，诱导相关细胞因子释放水平更高，具有更优越的抗肿瘤功效。[11]

基于circRNA技术可实现体内CAR-T疗法，无需分离患者体内T细胞进行编辑、扩增、再回输，相比体外CAR-T细胞疗法，具有成本低、便捷、现货、无需骨髓清除、可重复使用且无基因组整合风险等优势。利用免疫细胞趋向性的LNP体内递送编码anti-HER2 CAR蛋白的circRNA至模型小鼠体内，可显著抑制肿瘤生长，并诱导促炎症肿瘤微环境，联合肿瘤疫苗还可协同增强抗肿瘤活性。[12]

图5体内协同CAR-VAC免疫治疗机制。[12]

与CAR-T细胞类似，T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）也是一类经工程化改造的T细胞。递送编码CMV-pp65抗原的环状RNA到树突状细胞（moDCs）中，相比线性mRNA，能更加持久地提供抗原信号，更加高效地激活和扩增CMV-pp65特异性T细胞。[13]

05 蛋白替代

类似上述RiboX开发表达水通道蛋白AQP1的LNP-circRNA药物,利用circRNA持续长效表达功能性蛋白，有利于功能性蛋白的积累及发挥功效。

血管内皮生长因子(VEGF)在糖尿病足（DFU）的血管生成和促进创面愈合中起重要作用。然而，VEGF稳定性差，易于降解，难以持续输送到创面部位并发挥药理活性。而单剂U-LNP/VEGF-A circRNA制剂及可原位长效表达和释放VEGF-A，第12天即可使糖尿病小鼠创面几乎完全愈合，效果显著优于线性VEGF-A mRNA和rhVEGF。[14]

此外，利用LNP递送表达NGF的circRNA，可显著提高视网膜神经节细胞的存活率，效果远优于重组NGF蛋白治疗。[15]

图6基于环状RNA的NGF治疗的神经保护作用。[15]

利用可电离甘油脂质（TG6A）将编码FGF18蛋白的circRNA递送到间充质干细胞（MSC）中，可显著促进大鼠OA模型软骨修复。[16]

06 传染病治疗

circRNA在血液中同样具有较高的稳定性，作为传染病疫苗可提供强大的保护。此外，circRNA药物具有快速开发和大规模生产的优势，可快速有效应对爆发和传播迅速的传染性疾病。

表达SARS-CoV-2 S蛋白的三聚体RBD的circRNA疫苗，诱导有效的中和抗体和T细胞免疫反应，在小鼠和恒河猴中提供针对变种SARS-CoV-2的强大保护。[17]

图7对抗SARS-CoV-2的circRNA疫苗。[17]

混合多种表达猴痘病毒不同抗原的circRNA，可触发针对猴痘疫苗的有效保护。[18]

分别表达寨卡病毒（ZIKV）两种抗原的LNP-circRNA经过优化后，单剂量即可在小鼠体内提供有效和持久的保护作用，而不会诱导明显的登革热抗体依赖性增强效应。[19]

黄病毒（JEV）RNA可以复制并隐藏在ER相关膜结构中，circRNA表达修饰的Cas13以靶向ER(erCas13)，在sgRNA的引导下，可显著降低黄病毒感染水平，且与mRNA相比，可翻译更多的erCas13，具有更好的抗病毒活性。[20]

自我扩增mRNA（SAM）疫苗较少剂量(与线性mRNA相比)即可在较长时间内产生所需数量的抗原，从而产生强烈、持久的免疫反应。然而，SAM RNA也存在序列较长、可能引入突变、免疫原性较高、作用机制不稳定等问题。相比SAM，更安全地表达SARS-CoV-2-RBD抗原的circRNA疫苗诱导的TH1偏向性细胞免疫反应明显更高、更持久，并提供更有效的保护。[21]

07 细胞工程

表达相关分化因子的circRNA，可用于诱导多功能干细胞定向分化。H1人类多能干细胞(hPSC)中单次转染表达NEUROD1的circRNA，可在1周内分化为神经元。[5]

图8表达NEUROD1的circRNA更有效促进hPSC分化为神经元。[5]

08 核酸适配体

适配体是细胞中表达的短结构DNA或RNA，用于结合特定靶标并操纵细胞内过程。设计特殊三维结构的circRNA可作为适配体，如抗体一般高亲和力、特异性结合蛋白，用于捕获或隔离目标分子。

腺相关病毒（AAV）递送具有短双链结构的circRNA（ds-cRNA）适配体到神经元和小胶质细胞中，能够安全且有效抑制过度激活的蛋白激酶R（PKR），实现对阿尔茨海默病小鼠的神经保护、增强其空间学习和记忆能力。[22]

类似地，靶向脾脏的LNP递送ds-cRNA适配体，可实现PKR异常激活相关的炎性疾病小鼠模型银屑病的干预治疗。[23]

09 反义circRNA

CircRNA可通过与互补的RNA或DNA直接碱基配对，调节基因的表达。已经开发出反义环状RNA(AS-circRNAs)，通过靶向病毒基因组RNA结构保守的5'UTR，抑制SARS-CoV-2的复制，相比修饰的线性AS-RNA，表现出更强的抗病毒功效。[24]

图9靶向SARS-CoV-2 RNA的AS-circRNA设计。[24]

10 模拟天然circRNA

内源性circRNA在生物体内可作为miRNA分子海绵、蛋白支架，与DNA互作调控转录，翻译蛋白或多肽等机制调控基因表达。制备工程化天然circRNA模拟物，递送至体内实现特定circRNA的表达，可发挥其体内的功能。

circCDK13可形成circCDK13-IGF2BP3-mRNA复合物，稳定并上调CD44和c-MYC的表达。含高丰度circCDK13的工程化EV，能促进糖尿病小鼠模型的伤口愈合。[25]

在脓毒症小鼠的巨噬细胞中，circRNA SCAR表达下调，与M1过度极化有关。利用外泌体装载circRNA SCAR递送到巨噬细胞线粒体中，可在脓毒症小鼠模型体内减轻全身炎症。[26]

图10外泌体装载circRNA SCAR减轻脓毒症小鼠模型炎症的机制。[26]

11 生物传感器

利用circRNA的环状结构特点，还可以开发生物传感器。基于CRISPR系统设计环状crRNA，可抑制Cas12a切割位点特异性双链DNA和非特异性单链DNA。核酸酶（NAzymes）可使环状crRNA切割成线性，从而激活CRISPR-Cas12a。利用这原理开发的NA3C策略通过检测尿路感染患者尿液中大肠杆菌反应性RNA切割DNAzyme，从而高特异性（90%）、高灵敏度（100%）临床评估尿路感染。[27]

图11 NA3C用于ATP和大肠杆菌检测。[27]

Tornado表达的circRNA编码基于RNA的荧光传感器，在结合活细胞中的小分子后，产生的荧光强度是线性传感器的近200倍。[28]

12 miRNA分子海绵

体外合成的circRNA海绵是一种潜在的治疗策略，可靶向病理积累的miRNA。引入体外合成或异位表达的含有部分而非全部与miRNA互补结合位点的稳定circRNA，可降低细胞中与疾病相关的miRNA活性。

miRNA-122可与丙型肝炎病毒（HCV）RNA的5’端结合，保护HCV RNA免受核外解降解，从而增强病毒在肝细胞中的复制和翻译。利用设计circRNA分子海绵，功能性隔离miRNA-122，可更高效抑制病毒蛋白产生。[29]

13 蛋白分子海绵

类似部分circRNA在体内的作用机制，工程化circRNA也可设计作为蛋白分子海绵，以隔离病理性蛋白。

lncRNA NORAD可抑制Pumilio（PUM）蛋白参与细胞周期调节的mRNA编码因子,防止异常有丝分裂。设计多达8个PUM相应元件（PRE）的circRNA，可加强NORAD-PUM细胞体的形成，很大程度上挽救NORAD缺失的HCT116细胞中的染色体分离缺陷。[30]

图12基于circRNA的生物医学应用。[31]

以上，是否有你Pick的应用领域呢？工程化体外合成平台给予了circRNA更辽阔的未来，更明亮的前景。circRNA的应用仍在不断开发中，敬请期待……！！！

参考资料

[1]https://www.prnewswire.com/news-releases/ribox-therapeutics-announces-fda-clearance-for-ind-application-of-rxrg001-the-first-circular-rna-therapy-for-the-treatment-of-radiation-induced-xerostomia-and-hyposalivation-302287539.html

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