在 circRNA 原液合成中，产物相关杂质主要包括：线性 precusor RNA，circRNA 断裂而成的 nicked circRNA，掉落的 Introns，包含多个 CDS 的线性或者环状的串联高分子量RNA（HMW），circRNA 聚集体（Aggregates）。这些杂质的鉴定和分离一直是 circRNA 疫苗产业化过程的阵痛所在，尤其是一些具有相似分子量，不同结构的杂质分子，例如，circRNA 和 nicked RNA。2023 年 4 月份，美国药典（USP）发布了第二版《mRNA 疫苗质量分析方法》指南草案，涵盖线性 mRNA 整条生产线的分析方法，包括质粒DNA，mRNA 原液（Drug Substance），mRNA 制剂（Drug Product）。然而，WHO 和各国药监局尚未发布任何针对 circRNA 疫苗的质量分析指导草案。

与线性 mRNA 相比，闭环的 circRNA 可避免核酸外切酶介导的降解，在哺乳动物细胞中表现出更长的半衰期，表达蛋白的持续时间也更长。可是，这并不意味着 circRNA 永远不会被降解，在体内也存在各种降解 circRNA 的酶促途径。目前，大家对于circRNA 降解过程和降解产物的生物学功能并不是十分清楚。

正是鉴于上述原因，2024 年 7 月 1 号，中国食品药品检定研究院徐苗团队在 Chemosensors 发表文章：Study on the Characterization and Degradation Pattern ofCircular RNA Vaccines Using an HPLC Method，他们采用RP-HPLC来将circRNA和产物相关杂质成功区分开来，并且，对热加速降解条件下circRNA的降解模式以及降解产物的免疫原性展开研究。

基于 RP-HPLC 的 circRNA 纯度分析

采用 Qsep100 分析基于 I 型内含子合成的 EGFP circRNA 样品。未加入 RNase R 时，EGFP circRNA 合成液在 Qsep100 毛细管电泳图谱显示出两个峰。加入 RNase R 后，EGFP circRNA 酶切液在 Qsep100 毛细管电泳图谱只出现一个峰，紧挨的后峰消失。这说明加入 RNase R 不会发生降解的前峰是 circRNA，而加入 RNase R 发生降解的后峰是线性的 precusor RNA。Qsep100 毛细管电泳可以将 circRNA 与线性的 precusor RNA 区分开来，却无法将 circRNA 与 nicked circRNA 区分开来。

在反相色谱中，分析物在极性流动相和非极性固定相之间分配。非极性（疏水性）分析物与固定相之间发生非特异性相互作用，保留更强。通常极性化合物先洗脱，非极性化合物后洗脱。研究人员采用 RP-HPLC 系统来分析 EGFP circRNA 合成产物：选择 AcclaimTM 300 C18 柱（3μm），柱温保持在 55℃，移动相 A 为 100mM TEEA（三乙胺乙酸盐缓冲液），移动相 B 为 5% 100mM TEEA 和 95% 乙腈，流速 0.3mL/min。结果发现，在 RP-HPLC 色谱上，circRNA，Nicked RNA，Precusor RNA 非常明显地分离开来。

基于 ICH Q2(R2)分析方法验证指导原则，研究人员对 RP-HPLC 分析 circRNA 的专属性，检测限，定量限及精密度展开验证。专属性测试显示溶剂对 RNA 的检测形成干扰。circRNA，Nicked circRNA，Precusor 的检测限分别是 2.4、1.7、1.7ng/μL，而定量限分别是 7.1、5、5ng/μL。而且，多个检测人员检测多个 circRNA 样品的纯度分析结果偏差仅仅是 0.6%。上述验证结果表明采用 RP-HPLC 分析和鉴别 circRNA 和 Nicked circRNA 完全是可行的。

此外，虽然 RP-HPLC 选用的色谱柱温度要求 55℃，但是，与未加热对照组相比，将 circRNA 样品置于 55°C 下的流动相并不会引起 RP-HPLC 色谱峰图的显著变化。

最后，鉴于 USP 指导原则中采用 SEC-HPLC 分析线性 mRNA 聚集体，研究人员证实采用 SEC-HPLC 也可分析和定量 circRNA 样品中的聚集体。

circRNA 降解模式

根据 ICH 稳定性研究指南，将基于 RP-HPLC 纯化制备的 circRNA 样品至于不同存储温度下进行热加速稳定性测试。

RP-HPLC 结果显示：circRNA 在 4℃和 25℃存放一周后开始降解，在 37℃存放一天后开始降解。在 Nicked circRNA 产生过程中，其比例从 15%上升至 30%，增加存放时间会使其比例更进一步提升至 40%。随后，Nicked circRNA 比例开始下降，而 RNA 降解片段比例从 10%增加至 60%。也就是说，circRNA 在热加速实验中展现出来的降解模式是：circRNA→Nicked→RNA 降解片段。

利用 SEC-HPLC 分析不同温度下存放的 circRNA 样品。在 4℃和 25℃条件下，circRNA 随着存放时间的增加，聚集体和 circRNA 比例均发生下降，而 RNA 降解片段比例出现增加（9%~80%）。有意思的是，在 37℃条件下，随着存放时间的增加，circRNA 比例下降，RNA 降解片段比例出现增加，而聚集体比例会先增加降低。整体来看，SEC-HPLC 结果表明 circRNA 样品在不同温度存放过程中，circRNA 和聚集体的降解伴随着 RNA 降解片段的形成。

circRNA 及杂质的表达活性

研究人员纯化分离收集 EGFP circRNA、Nicked circRNA、聚集体、降解片段及 precursor RNA，转染 A549 细胞，采用流式和荧光共聚焦扫描显微镜检测上述成分各自的 EGFP 表达活性。从转染后 24h~72h，circRNA 表现出持续的、增加的 EGFP 蛋白表达水平。precursor RNA 和降解片段根本不表达 EGFP 蛋白。Nicked circRNA 和聚集体表现出极低的 EGFP 蛋白表达水平（分别为 circRNA 荧光强度的 1/5 和 1/20）。

circRNA 及杂质的免疫原性

采用 LNP 包封未纯化/纯化 EGFP circRNA、Nicked circRNA、聚集体、降解片段及 precursor RNA。分别向小鼠体内肌肉注射 10ug 上述 RNA 制剂，测定血清中的炎症细胞因子和 EGFP lgG 水平。

注射 12h 后，与空壳 LNP/PBS（190 和 2pg/mL）相比，注射 circRNA 及其杂质 RNA 制剂的小鼠血清中促炎细胞因子水平明显升高很多（3200~5700pg/mL）。

与细胞水平 EGFP 表达相似，precursor RNA 和降解片段 LNP 制剂注射组血清中未检测到 EGFP lgG。直接从 IVT 中获取的未纯化 circRNA 和纯化 circRNALNP 制制剂注射组小鼠血清中可检测到很高的 EGFP lgG 滴度，而 Nicked circRNA 和聚集体 LNP 制剂注射组血清中的 EGFP lgG 滴度要降低很多。

circRNA 及杂质激活的模式识别受体

既然 circRNA 及其产物相关杂质均会明显触发细胞释放促炎细胞因子，那就很有必要搞清楚它们各自激活的细胞模式识别受体是否有区别？将 EGFP circRNA 及其产物相关杂质分别转染特定的模式识别受体报告基因细胞。与野生型细胞相比，敲除 RIG 基因导致 circRNA 触发的荧光水平降低，敲除 TLR3/8 导致 Nicked circRNA 触发的荧光水平降低，敲除 TLR7/8 导致聚集体和降解片段触发的荧光水平降低，敲除 TLR3 导致 precursor RNA 触发的荧光水平降低。

总结

目前，监管机构缺乏关于 circRNA 疫苗的质量控制研究的指导文件。circRNA 原液合成中会出现好几种产物相关的杂质，而且，这些杂质与 circRNA 之间的区分度不是很好。这项研究建立的 RP-HPLC 纯度分析方法可以很好地将 circRNA 与 Nicked circRNA 区分开来。同时，还发现在热加速稳定性实验中，circRNA 降解模式为:circRNA→Nicked→RNA 降解片段。更加重要的是，这项研究在细胞水平和小鼠体内检测了 circRNA 及杂质 RNA 的蛋白表达水平和免疫原性，发现只有 circRNA 表达水平和表达时间最长，circRNA 及杂质 RNA 还会强烈触发促炎因子的释放，在细胞内拥有不同的模式识别受体。

关于 circRNA 及杂质的分析，旧文也曾数次提及，不同的分析方法，circRNA 及杂质出现的位置均是不相同的，很容易让人混淆。我们在这里总结归纳如下：

在 Qsep100 毛细管电泳中，circRNA 迁移速度＞Precusor RNA，因此，peak 1 为 circRNA，peak 2 为 Precusor RNA，circRNA 与 Nicked cirRNA 无法区分开。

在天然琼脂糖凝胶电泳中（Agarose），circRNA 迁移速度＞Precusor RNA，在胶图上面的条带是 Precusor RNA，下面的是 circRNA，circRNA 与 Nicked cirRNA 无法区分开。

在尿素变性 PAGE 凝胶电泳中，Precusor RNA 迁移速度＞circRNA，在胶图上面的条带是 circRNA，下面的条带是 Precusor RNA。

在Thermo Fisher 预制胶 E-Gel EX电泳系统中，circRNA 在电泳胶图中呈现的表观 Size 远超过其实际 Size，电泳条带分布：circRNA>Precusor RNA> Nicked RNA。需要特别注意的是，在 E-Gel EX 电泳系统中，circRNA 迁移速率会受到上样缓冲 buffer，染料，电压的影响。

在 SEC-HPLC 中，迁移速度为 HMW＞Precusor RNA＞Nicked circRNA＞circRNA＞Introns，在色谱图上，Precusor RNA，circRNA，Introns 三个峰最为明显，分离度也高。

在RP-HPLC，迁移速度为 circRNA＞Nicked RNA＞Precursor RNA。

以下文章来源于BioFactory ，作者留胡子的豆腐