突破！吉赛联合创始人共一参与Cell Metabolism揭开隐藏数亿年的线粒体基因翻译新模式

作者：EP

校稿：张茂雷

2024年5月3日，吉赛生物联合创始人张茂雷均等贡献第一作者在Cell Metabolism（IF=29）上发表题为“A novel protein CYTB-187AA encoded by the mitochondrial gene CYTB modulates mammalian early development”的研究论文，中国科学院广州生物医药与健康研究院刘兴国研究员为文章通讯作者。该研究首次发现线粒体可翻译第14个全新功能蛋白，改写了半个多世纪以来关于线粒体基因组只翻译13个蛋白的定律，揭开隐藏数亿年的线粒体基因翻译新模式。

研究团队首先在CYTB基因上查找到一个标准的ORF，利用高精度液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 鉴定了CYTB-187AA的外源性特征肽，在多株人、鼠的细胞中鉴定了多条匹配的内源特征肽。团队使用MoonTag系统可视化CYTB-187AA信使RNA 在胞质核糖体的翻译，并使用定制CYTB-187AA特异性抗体通过蛋白免疫印迹在多株人、鼠的细胞中检测到了CYTB-187AA。研究通过比较线粒体基因组缺失细胞和野生型细胞，发现CYTB-187AA仅在后者表达；然后进一步发现EB和IMT1B能降低CYTB-187AA的表达，从而论证了这一新蛋白由线粒体基因组编码至胞质翻译。

图1. 在CYTB编码区有一个187个氨基酸的ORF，使用标准遗传密码编码一种新的蛋白CYTB- 187aa

研究团队通过细胞转染荧光标记的CYTB-187AA，发现这一蛋白在胞质翻译后又返到线粒体内。通过片段删除的方法，团队锁定了N端的37个氨基酸在靶向线粒体中起到了决定性作用。进一步通过超高分辨显微镜，团队清晰的标记了线粒体的双层膜的各个空间，论证了CYTB-187AA定位到线粒体基质中。

图2. CYTB-187AA定位于线粒体基质中

研究团队发现，与来源的成纤维细胞或分化的肝细胞相比，CYTB-187AA在相应的诱导多能干细胞（iPSC）中的表达量更高。哺乳动物的多能干细胞的原始态（naive）和始发态（primed），分别对应着床前囊胚的内细胞团与着床后的外胚层细胞。研究通过过表达和敲低CYTB-187AA进行细胞实验，结果表明，CYTB-187AA是原始态所必需的，并调控naive和primed两种状态的转换过程。

图3.CYTB-187AA促进primed-to-naive transition (PNT)

研究团队通过Co-IP实验鉴定了CYTB-187AA与线粒体磷酸盐载体SLC25A3互作，且进一步验证了SLC25A3在ESCs中表达高于EpiSCs，敲低SLC25A3降低了PNT效率；而沉默CYTB-187AA降低了SLC25A3的表达；沉默CYTB-187AA导致的ATP水平下降，可通过过表达SLC25A3进行挽救。结果表明，CYTB-187AA通过与线粒体磷酸转运蛋白SLC25A3相互作用，以ATP依赖的方式进行调控。

图4. CYTB-187AA与SLC25A3相互作用

图5. CYTB-187AA与SLC25A3相互作用促进PNT

研究进一步建立了CYTB-187AA敲降小鼠模型并进行体内功能的研究，研究发现与WT/WT雌性小鼠相比，WT/sh187和sh187/sh187小鼠卵巢中的CYTB-187AA水平较低。研究通过卵巢组织病理学检查，发现CYTB187AA基因敲低减少了卵巢卵泡的数量，但不影响原始卵泡、生长卵泡、成熟卵泡和闭锁卵泡的比例。综上所述，CYTB-187AA基因敲低可减少雌性小鼠卵巢卵泡数量，降低雌性小鼠的生育能力。

图6. 敲低CYTB-187AA可降低雌性小鼠的生育能力

图6. 敲低CYTB-187AA可减少卵巢卵泡数量

在这项研究中，刘兴国研究团队发现了线粒体编码基因CYTB的双重翻译模式，即除了在复合体III中的CYTB外，CYTB还编码一种新的线粒体基质定位的蛋白CYTB-187aa。CYTB-187aa通过线粒体DNA编码胞质翻译蛋白的“线粒体约定”新模式(mtDNA-encoded proteins arising from cytosolic translation, mPACT)进行表达。CYTB-187aa与SLC25A3相互作用，调节ATP的产生，从而调节哺乳动物早期发育。

该研究工作首次发现线粒体可使用细胞质标准密码翻译第14个功能蛋白，打破传统观点认为的线粒体基因只翻译13个蛋白的定律。线粒体基因可分别使用两套密码子翻译系统产生不同序列的功能蛋白，且存在线粒体mRNA的新型mPACT模式，此种生命现象的发现为线粒体的基础生物学功能探索提供新角度。