服务介绍
RNA作为生物体内的遗传信息载体，根据结构和功能的不同分为信使RNA（Messenger RNA，mRNA）和非编码（Non-coding RNA，ncRNA），在基因调控层面，这些RNA分子起到了至关重要的作用。
吉赛生物研发的第五代RNA过表达载体可对mRNA/lncRNA/circRNA分子实现精准表达，能满足普通真核表达、慢病毒包装和腺相关病毒（AAV）包装等多种用途。其中circRNA载体均携带优化过的侧翼成环框架，含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的结合位点，并使用全新设计的环化介导序列，使插入的circRNA准确高效环化，mRNA及lncRNA表达载体携带强启动子及KOZAK序列，使mRNA/lncRNA精准正确表达。
过表达分子类型 | 载体名称 | 抗性 | 荧光标记 | 应用 | ||
瞬转细胞 | 包装慢病毒 | 包装腺相关AAV病毒 | ||||
circRNA | pCD5-ciR | AmpR | 无 | √ | × | × |
pCD25-ciR | AmpR | eGFP | √ | × | × | |
pLO5-ciR | AmpR/PuroR | 无 | √ | √ | × | |
pLC5-ciR | AmpR/PuroR | eGFP | √ | √ | × | |
pK5ssAAV-ciR | AmpR | 无 | √ | × | √ | |
pK25ssAAV-ciR | AmpR | eGFP | √ | × | √ | |
mRNA&lncRNA | pCDNA3.1 | AmpR | 无 | √ | × | × |
pCDH | AmpR | eGFP | √ | √ | × | |
ssAAV.CMV.EGFP.WPREs | AmpR | eGFP | √ | × | √ | |
技术优势
1. 过表达效率高；
2. 特异性强、准确率高：优化筛选过的表达元件有效保证目标RNA分子的序列准确表达；
3. 稳定性高：mRNA、lncRNA（100-3000nt序列）；circRNA（200-2500nt序列）均能实现准确高效过表达；
4. 适用范围广：可用于细胞转染、包装慢病毒或腺相关病毒，同时可提供GFP绿色荧光蛋白标记和嘌呤霉素抗性基因标记，适用于客户不同的实验需求。
服务流程
1. 载体构建；
2. 瞬时转染；
3. 特异性引物设计合成；
4. RT-qPCR验证；
5. Sanger测序验证；
6. 病毒包装（可选，列于病毒包装项目）
客户提供
1. 基因ID/物种/全长序列
2. 载体名称
我们提供
1. 目的载体：10μg质粒+200μL甘油菌/对照载体：10μg质粒+200μL甘油菌；
2. 载体构建与验证实验报告：
① 载体构建步骤；
② 载体测序验证结果原始文件；
③ 细胞转染实验步骤；
④ qPCR实验流程方案及产物测序；
⑤ 载体构建与验证实验报告。
案例1：
2020年9月14日，中山大学孙逸仙纪念医院苏士成教授合作团队在Cell杂志（IF 41.584)上发表了题为Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output的文章，该文章应用Arraystar Human CircRNA芯片筛选鉴定出与非酒精性脂肪性肝炎发生相关的环状RNA分子SCAR，并发现在线粒体中过表达circRNA SCAR能够抑制肝脏成纤维细胞的活化与相应的炎症反应，敲低则有相反的表型。并且作者使用吉赛公司过表达载体 pcD-ciR 通过插入3×flag标签以及预测的ORF序列（图1），发现circRNA SCAR无法编码蛋白质，随后作者通过一系列实验发现该circRNA能够直接与ATP5B结合并发挥生物学功能[1]。作者团队发现了线粒体circRNA的重要功能并发展了一系列相关的实验方法，为免疫代谢疾病提供了一种有吸引力的治疗策略。
参考文献：
Qiyi Zhao, Jiayu Liu, Hong Deng, et al. Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output.Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009
案例2：
参考文献：
Song R, Ma S, Xu J, Ren X, Guo P, Liu H, Li P, Yin F, Liu M, Wang Q, Yu L, Liu J, Duan B, Rahman NA, Wołczyński S, Li G, Li X. A novel polypeptide encoded by the circular RNA ZKSCAN1 suppresses HCC via degradation of mTOR. Mol Cancer. 2023 Jan 23;22(1):16. doi: 10.1186/s12943-023-01719-9. PMID: 36691031; PMCID:PMC9869513.
qRT-PCR检测
图1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达差异
表1 hsa_circ_00AAAAA的相对表达量
qPCR产物测序结果：
注：hsa_circ_00AAAAA在circBase中的环化位点序列GATTATGGAAACAGCTTTTTATAACTATGATG
结论：
相比于对照组，CAAAAA组的过表达倍数为***；PCR产物测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列与环化位点参考序列对比吻合。以上结果表明CAAAAA能在真核细胞中成功过表达目的hsa_circ_00AAAAA。
1. circRNA过表达怎么做？
CircRNA的形成和线性RNA不同，因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体（如pcDNA3.1）来进行。已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列（RCMs，如Alu元件）或与能调控circRNA生成的蛋白（如QKI）的结合位点，因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列，质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链，再依靠长下游的反向互补配对促使成环。
2. circRNA过表达成功标准？
载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。
1）qPCR检测有过表达倍数，质粒瞬转效率高，基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上；
2）使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带，PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。
