Nanopore cDNA-PCR测序

服务介绍

Nanopore cDNA-PCR测序是指基于牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代测序平台进行全长转录组测序，无需打断，可直接读取从5’端到3’端polyA尾的高质量单个RNA分子全长序列，准确辨别二代测序无法准确识别的可变剪接（AS）、融合基因、lncRNA及其靶基因，且可同时对基因和转录本进行定量分析。ONT全长转录组已广泛应用于生长发育、环境适应、免疫互作、突变表型、肿瘤的发生、临床诊断和药物研发等领域。

Nanopore cDNA-PCR测序流程图

测序方案

测序模式：Nanopore Sequencing

测序数据量：4Gb/样，or 6Gb/样

技术优势

1. Nanopre全长转录组测序无需打断RNA，可获得5’到3’全长转录本序列及其表达信息，对片段大小无偏好，直接检测电信号无需边合成边测序其GC偏好性远低于二代平台；

2. 由于无需拼接其在转录本层面的结构变异检测方面，比如可变剪接、融合基因、APA、新基因预测等具有绝对优势；

3. 除了可准确鉴别转录本结构变异，还可实现转录本（mRNA或polyA+ lncRNA）表达水平准确定量。

Nanopore long-read RNAseq reveals widespread transcriptional variation among the surface receptors of individual B cells

发表杂志：Nature Communications

影响因子：12.121

短reads RNAseq解析复杂isoform的能力有限，因为它无法测序RNA分子的全长cDNA拷贝。作者研究了使用长读取单分子Oxford Nanopore测序仪的RNAseq是否能够在不牺牲准确的基因表达定量的情况下，鉴定和定量复杂的isoform。在小鼠B1a细胞中鉴定了数千个未注释的转录起始和终止位点，以及数百个可变剪接事件，鉴定了在B1a细胞中表达的数百种基因，这些基因显示出多种复杂的isoform，包括几种B细胞特异性表面受体。本研究表明，可以在单细胞水平上识别和定量复杂的isoform。

图1 ONT RNAseq数据分析确定小鼠B1a细胞的异构体特征

图2 揭示B细胞表面受体的异构体多样性

生信分析

ONT原始数据质控

比对结果质控检查

转录本定量

差异转录本鉴定

转录因子预测

功能注释

富集分析

蛋白质互作网络

可变剪接分析

融合转录本

新转录本发现

基因结构优化

Table. Nanopore cDNA-PCR Sequencing样本送样建议